چگونه مقاله بنویسیم؟

• چگونه مقاله منتشر کنیم؟
• پزشکی مبتنی بر شواهد
• مرور سیستماتیک جناب آقای دکتر مجد زاده و همکاران
• داوری و نقد مقاله
• جستجوی منابع الکترونیک سطح 1
• جستجوی منابع الکترونیک سطح 2
• جستجوی منابع الکترونیک سطح 3
• EndNote
• Reference Manager
• مروز سیستماتیک جناب آقایان دکتر پیام کبیری و دکتر علی میرزازاده
• مرور سیستماتیک سرکار خانم ها دکتر نجات و دکتر غلامی و جناب آقای دکتر استوار

عفونت توام ناشي از ليشمانيا و HIV (Leishmania / HIV Co-infection)

ليشمانيوز

  سالانه حدود 2-5/1 ميليون مورد ليشمانيوز پوستي و 500000 مورد ليشمانيوز احشائي در سطح جهان، رخ مي دهد. ليشمانيوز احشائي، شديدترين چهرة باليني ليشمانيوز است كه به دو شكل اپيدميولوژيك، بروز مي نمايد :

 شكل زئونوتيك (Zoonotic) در حوزه مديترانه كه سگ به عنوان منبع اصلي عفونت براي حشرة ناقل، مطرح مي باشد

شكل انساني (Anthroponotic) در شرق آفريقا، بنگلادش، هند و نپال كه از طريق پشه خاكي سندفلاي، از انسان به انسان منتقل مي شود.

      در افرادي كه دچار نقص ايمني نمي باشند عفونت حاصله در اغلب موارد به صورت بدون علامت يا تحت باليني، باقي مي ماند و در موارد با علامت باليني، معمولا به دنبال پشت سر گذاشتن دوره كمون چندهفته تا چندماهه، علائمي نظير: تب، كاهش وزن شديد، هپاتواسپلنومگالي و پان سيتوپني، عارض مي گردد و در صورت عدم درمان، ممكن است به مرگ بيماران منجر شود0

عفونت همزمان ليشمانيا/HIV

            شكل باليني اصلي اين بيماري شامل وقوع همزمان ليشمانيوز احشائي و HIV/AIDS است كه در سال هاي اخير، بويژه در جنوب غربي اروپا باعث طغيان هاي متعددي گرديده است ولي ندرتا ممكن است با وقوع توأم ليشمانيوز پوستي و HIV/AIDS نيز مواجه شويم. نوپديدي ليشمانيا/HIV حاصل گسترش جهانگيري ايدز در مناطق روستائي و توسعة ليشمانيوز احشائي به حاشيه شهرها است. اين نوپديدي باعث تاثير عظيمي بر جنبه هاي باليني، تشخيصي، درماني و اپيدميولوژيك ليشمانيوز، گرديده است.

            هرچند اين نوپديدي در بيش از 33 كشور، رخ داده است ولي بيشترين موارد آن در جنوب غربي اروپا و بخصوص در فرانسه، ايتاليا، پرتغال و اسپانيا حادث گرديده است (نقشه 4).

توزيع سني بيماران

            طي سال هاي اخير، در بسياري از كشورهاي اروپائي، تغييرات اپيدميولوژيك عظيمي در الگوي ليشمانيوز احشائي، حاصل شده است. به طوري كه ليشمانيوز احشائي كه معمولا در بين كودكان حادث مي گرديد امروزه بيشتر در بالغين، رخ مي دهد و حدود 9/76% موارد در سنين 50-31 سالگي مي باشند كه منطبق بر محدوده سني معتادان تزريقي مبتلا به HIV/AIDS است (نمودار 25 و 26).

عفونت همزمان HIV و گونه هاي ليشمانيا به نحو شايعي به صورت ليشمانيوز احشائي، تظاهر مي نمايد.

وضعيت ايمونولوژيك بيماران

            ابتلاء به ايدز، خطر بروز ليشمانيوز احشائي را به ميزان 1000-100 برابر، افزايش مي دهد و علاوه بر آن شدت ليشمانيوز احشائي در زمينه HIV/AIDS بيشتر از كساني است كه مبتلا به ايدز نيستند و جالب توجه است كه ليشمانيوز نيز اثرات متقابلي بر سير HIV/AIDS اِعمال مي كند. به طوري كه بر ميزان تكثير ويروس و شدت نقص ايمني، مي افزايد و در نتيجه، اغلب بيماران، داراي لنفوسيت هاي CD4+T كمتر از 200 مي باشند و طبيعي است كه تحت چنين شرايطي ساير عفونت هاي فرصت طلب نظير توبركولوز، كانديدياز، پنوموني ناشي از پنوموسيستيس كاريني . . . و توكسوپلاسموز نيز با شيوع بيشتري عارض مي شوند.

تشخيص باليني

تشخيص ليشمانيوز احشائي در مبتلايان به ليشمانيا/HIV، مشكل مي باشد. زيرا تظاهرات باليني شايع بيماري نظير تب، كاهش وزن و ارگانومگالي، هميشه وجود نداشته و يا تحت تاثير علائم مشترك ناشي از ساير عفونت هاي فرصت طلب، قرار مي گيرد. با اين وجود براساس مطالعه اي كه در بيماران اروپائي صورت گرفته است اين بيماران در اغلب موارد دچار علائم اصلي ليشمانيوز احشائي بوده اند. شايان ذكر است كه در بيماران مبتلا كه HIV/AIDS كه ضمنا دچار تب، ارگانومگالي و آنمي نيز مي باشند بايد با ظنّ باليني قوي به كالاآزار نيز فكر كرد و در مورد سابقه سكونت يا مسافرت به مناطق آندميك بيماري، تحقيق نمود.

نقشه 4 ـ انتشار جغرافيائي ليشمانيا / HIV

نمودار 25 ـ توزيع سني مبتلايان به ليشمانيا/HIV و معتادان تزريقي در كشورهاي اروپائي

نمودار 26 ـ توزيع بيماران مبتلا به ليشمانيا/HIV برحسب زمينه هاي مختلف

نمودار 27 ـ ميزان حساسيت تست هاي سرولوژيك كالاآزار در مبتلايان به ليشمانيا/HIV

تشخيص سرولوژيك

            پاسخ منفي ايمني هومورال در 6/42%  مبتلايان به ليشمانيا/HIV جلب توجه مي كند (نمودار 27) و از آنجا كه بر حسب نوع آزمون مورد استفاده ممكن است پاسخ هاي متفاوتي دريافت شود توصيه شده است همواره از تعداد 2 يا چند تست سرولوژيك، استفاده شود (نمودار 28).

نمودار 28 - ميزان مثبت شدن تست هاي سرولوژيك كالاآزار برحسب نوع آزمون

تشخيص انگل شناسي

            تشخيص پارازيتولوژيك به منطور كشف انگل ليشمانيا در ارگان هاي بدن، از ارزش والائي برخوردار است. آسپيراسيون مغز استخوان مخصوصا زماني كه به طور مكرر در طي روزهاي آغازين بيماري، تهيه شود يكي از حساسترين روش هاي تشخيصي به حساب مي ايد و در 5/93% موارد، نتايج مثبتي به بار مي آورد. ضمنا در صورت شروع درمان يا عود بيماري به منظور افزايش حساسيت تشخيصي، مي توان از كشت مغز استخوان، استفاده نمود. همچنين با توجه به تراكم انگل در خون محيطي از آزمون Buffy-coat نيز مي توان استفاده كرد.

گرفتاري سيستم ادراري تناسلي

            همة بيماري هاي مقاربتي ممكن است باعث تسهيل انتقال HIV بشوند. از طرفي در افراد مبتلا به عفونت ناشي از HIV بيماري سيفيليس و عفونت ناشي از HPV با سرعت بيشتري به مراحل پيشرفته، سير نموده و با احتمال بيشتري باعث ايجاد كانسر دهانة رحم مي گردد. سيفيليس اوّليه يا ثانويّه معمولا همراه با مثبت شدن آزمون هاي سرمي بوده و با سرعت بيشتري به سمت نروسيفيليس، به پيش مي رود.

آلگوريتم 1 ـ مراحل تشيخص HIV/AIDS

پيشگيري اوّليه و ثانويه عفونت هاي فرصت طلب در زمينه HIV/AIDS

آنسفاليت توكسوپلاسمائي

پيشگيري از تماس ها

افراد مبتلا به عفونت ناشي از  HIV  بايد هرچه سريعتر از نظر وجود  IgG  ضد توكسوپلاسما به منظور كشف عفونت نهفته توكسوپلاسمائي مورد بررسي قرار گيرند و كليّه افراد مبتلا به عفونت ناشي از HIV و ازجمله افرادي كه فاقد آنتي بادي IgG ضد توكسوپلاسما هستند بايد مورد مشاوره قرار گيرند و آموزش هاي لازم در زمينه راه هاي پيشگيري از بروز عفونت توكسوپلاسمائي به آنان داده شود.

به اين بيماران بايد توصيه شود از خوردن مواد گوشتي كه به طور كامل پخته نشده است اكيدا خودداري كنند. لازم به تاكيد است كه حرارت داخل گوشت گوسفند، گوساله و خوك بايد به حدود 175-170 درجه سانتيگراد برسد و با توجه به اينكه تحت چنين شرايطي رنگ صورتي وسط گوشت از بين خواهد رفت لازم است اين نكته عملي مهم به افراد HIV مثبت، تعليم داده شود. همچنين به آنها آموخته شود كه بعد از تماس با گوشت خام و خاك، دستان خود را بشويند و از خوردن ميوه ها و سبزي هاي خام نَشسته نيز اكيدا پرهيز نمايند و اگر در منزل، گربه نگهداري مي كنند تخته كف لانه گربه را روزي يك بار به وسيله يك نفر HIV منفي غيرحامله، تعويض كنند و ضمن جلوگيري از خروج اينگونه گربه ها از منزل مانع تماس آنها با گربه هاي ولگرد شوند و همواره آنها را با غذاهاي پخته شده و يا غذاهاي خشك آماده، تغذيه نمايند و به منظور سهولت كار و معافيت از خدمت رساني افراد HIV مثبت به گربه ها احتياط واجب آنست كه توصيه شود از نگهداري گربه در منازل، خودداري كنند.

پيشگيري اوّليه (پيشگيري از بروز بيماري)

افرادي كه از نظر آزمون سرمي توكسوپلاسما مثبت هستند و لفنوسيت هاي CD4+ T آنها كمتر از 100 مي باشد بايد تحت پوشش پيشگيرنده داروهاي موثر بر آنسفاليت توكسوپلاسمائي قرار گيرند. لازم به يادآوري است كه در صورتي كه اين افراد تحت پوشش پروفيلاكسي با روزانه 2 قرص معمولي كوتريموكسازول به منظور پيشگيري از PCP هستند همين اقدام باعث پيشگيري از بروز آنسفاليت توكسوپلاسمائي نيز خواهد شد. ضمنا آتوواكن به تنهائي يا همراه با پريمتامين نيز موثر واقع مي گردد ولي تك درماني با داروهائي نظير داپسون، پريمتامين، آزيترومايسين يا كلاريترومايسين، توصيه نمي شود و افشانه پنتاميدين نيز موثر نمي باشد.

افرادي كه از نظر آزمون هاي سرمي توكسوپلاسما منفي هستند و تحت پوشش داروهاي پيشگيرنده  PCP موثر بر آنسفاليت توكسوپلاسمائي نمي باشند بايد زماني كه تعداد لنفوسيت هاي CD4+ T آنها به كمتر از 100 رسيد مجددا از نظر عفونت توكسوپلاسمائي، بررسي شوند و به هنگام بروز تغييرات سرمي از منفي به مثبت، تحت پوشش پروفيلاكسي قرار گيرند.

زمان قطع پروفيلاكسي اوّليه

جوانان و بالغيني كه تحت پوشش درماني با HAART هستند در صورت پاسخ درماني و افزايش لنفوسيت هاي CD4+ T به بيش از 200 و تداوم آن به مدّت بيش از سه ماه مي توانند از ادامه پروفيلاكسي عليه توكسوپلاسموز، خودداري كنند.

پيشگيري ثانويّه (پيشگيري از عود)

بيماراني كه دوره درماني اوّليه ضد آنسفاليت توكسوپلاسمائي را پشت سر گذاشته اند بايد تا پايان عمر، تحت درمان سركوبگر نيز قرار گيرند مگر اينكه ايمني آنان تحت تاثير درمان با HAART به وضعيت طبيعي باز گردد.

در اين بيماران مصرف توام پريمتامين + سولفاديازين + ويتامين B6 به منظور درمان سركوبگر، از تاثير والائي برخوردار است و در صورت عدم تحمّل سولفاميدها، مي توان از پريمتامين + كليندامايسين، نيز استفاده نمود. البته بايد توجه داشت كه سولفاديازين + پريمتامين از بروز PCP نيز جلوگيري مي كند.

زمان قطع پروفيلاكسي ثانويّه

جوانان و بالغيني كه تحت پوشش پروفيلاكسي ثانويّه براي آنسفاليت توكسوپلاسمائي هستند مشروط بر اينكه درمان آنسفاليت توكسوپلاسمائي را با موفقيت پشت سر گذاشته، فاقد علائم باليني بوده و تعداد لنفوسيت‌ هاي CD4+ T آنها به طور پايداري در محدوده بيش از 200 باقي بماند از نظر عود آنسفاليت توكسوپلاسمائي در معرض خطر بالائي نخواهند بود و تحت اين شرايط مي توان از ادامه درمان سركوبگر، خودداري نمايند.

شروع مجدد پيشگيري ثانويّه

در صورتي كه تعداد لنفوسيت هاي CD4+ T به كمتر ار 200 سلّول كاهش يابد بايد رژيم درماني سركوبگر را مجددا آغاز نمود.

وضعيت هاي خاص

كودكان

در صورتي كه كودكان، تحت پوشش پروفيلاكسي PCP با كوتريموكسازول باشند در مقابل آنسفاليت توكسوپلاسمائي نيز محافظت مي گردند و آتوواكن نيز در آنان موثر خواهد بود.

كودكان بيش از 12 ماهه اي كه تحت پوشش پروفيلاكسي PCP هستند و داروهائي غير از كوتريموكسازول يا آتوواكن دريافت مي نمايند بايد از نظر عفونت توكسوپلاسمائي نيز بررسي شوند. از طرفي توصيه شده است كودكاني كه دچار سركوب شديد سيستم ايمني هستند و آزمون سرمي آنها از نظر آنتي بادي ضد توكسوپلاسما مثبت است بايد عليه توكسوپلاسموز و PCP تحت پوشش پيشگيري داروئي، قرار گيرند و داپسون باضافه پريمتامين، دريافت كنند. همچنين كودكاني كه سابقه  ابتلاء به توكسوپلاسموز را داشته اند به منظور پيشگيري از عود بيماري، لازم است تا پايان عمر، تحت پوشش پروفيلاكسي، قرار گيرند.

شايان ذكر است كه وضعيت كودكاني كه تحت پوشش پروفيلاكسي اوّليه يا ثانويّه بوده اند به خوبي مطالعه نشده است.

زنان باردار

كوتريموكسازول را به همان شيوه اي كه به منظور پروفيلاكسي PCP توصيه كرده اند براي پيشگيري توكسوپلاسموز نيز قابل توصيه است ولي از آنجا كه از يك طرف خطر بروز آنسفاليت توكسوپلاسمائي، در دوران بارداري در حد پائيني قرار دارد و از طرف ديگر خطر بالقوه پريمتامين در اين دوران به اثبات رسيده است، توصيه كرده اند تجويز رژيم هاي داروئي حاوي پريمتامين، به بعد از ختم بارداري، موكول گردد.

در موارد نادري زنان حامله HIV+ كه داراي شواهد سرولوژيك عفونت توكسوپلاسمائي قديمي بوده اند عفونت را به جنين خود منتقل كرده اند و لذا توصيه شده است زنان باردار HIV+ كه دچار عفونت اوّليه توكسوپلاسمائي يا بيماري توكسوپلاسموز و از جمله آنسفاليت توكسوپلاسمائي هستند به دقت مورد ارزيابي و درمان قرار گيرند و نوزادان آن ها نيز پس از تولّد از نظر توكسوپلاسموز مادرزادي، مورد بررسي قرار گيرند.

كريپتوسپوريديوز

پيشگيري از تماس ها

افراد مبتلا به عفونت ناشي از HIV بايد در مورد راه هاي مختلف انتقال كريپتوسپوريديوم، تحت آموزش قرار گيرند. اين راه ها عبارتند از تماس مستقيم با بالغين مبتلا، شيرخواران، حيوانات ، آب آشاميدني و غذاهاي آلوده. اين بيماران بايد از تماس با مدفوع انسان و حيوانات، اجتناب كنند و در صورت تماس، دستان خود را به دقت بشويند. همچنين بعد از تماس با حيوانات خانگي و پس از تماس با خاك (باغباني و . . .) نيز به شستشوي دستها بپردازند و از رفتارهاي جنسي كه منجر به تماس مدفوعي ـ دهاني مي شود نيز اكيدا اجتناب نمايند.

اين افراد نبايد از آب جويبارها و رودخانه ها بنوشند و نسبت به اين واقعيت كه بسياري از آب ها ممكن است آلوده به مدفوع انسان يا حيوانات و به تبع آن آلوده به كريپتوسپوريديوم هستند آگاهي كافي داشته باشند و حتي از شنا كردن در آب هاي مشكوك، بپرهيزند و در صورتي كه در اينگونه آب ها شنا مي كنند بايد از بلع آب به طور جدّي خودداري كنند. ضمنا بايد توجه داشته باشيم كه يخ هائي كه از آب آلوده به كريپتوسپوريديوم تهيه مي گردد نيز ممكن است منبع عفونت باشند و آب ميوه ها و بسياري از نوشيدني هاي غيرپاستوريزه ديگر نيز ممكن است آلوده باشند.

شايان ذكر است كه در صورت آلودگي آب آشاميدني به كريپتوسپوريديوم، جوشاندن آن به مدت يك دقيقه باعث از بين رفتن اووسيست هاي انگل مي گردد. در مجموع با توجه به اينكه به دلايل مختلفي ممكن است آب هاي آشاميدني، آلوده به اين انگل شوند توصيه شده است افراد HIV+ سعي كنند همواره از آب جوشيده استفاده نمايند. ضمنا افراد HIV+ بايد از مصرف صدف خوراكي خام نيز بپرهيزند زيرا اووسيست هاي كريپتوسپوريديوم ممكن است تا بيش از دو ماه در بدن صدف زنده بمانند.

در بيمارستان ها، رعايت احتياط‌ هاي استاندارد، معمولا مانع انتقال عفونت از افراد بيمار توسط كاركنان مي شود ولي از آنجا كه ممكن است اووسيست ها از طريق وسايل نير انتقال يابند برخي از متخصصين، توصيه كرده اند افراد مبتلا به عفونت ناشي از HIV و مخصوصا افرادي كه دچار سركوب شديد ايمني هستند نبايد با مبتلايان به كريپتوسپوريديوز در يك اطاق بستري گردند.

پيشگيري از بروز و عود بيماري

بيماراني كه ريفابوتين يا كلاريترومايسين به منظور پروفيلاكسي MAC مصرف مي كنند ممكن است در مقابل كريپتوسپوريديوزيس نيز محافظت شوند. ولي با اين وجود هنوز دلايل كافي براي تجويز اين داروها به عنوان پروفيلاكسي كريپتوسپوريديوزيس وجود ندارد. همچنين در مورد پيشگيري از عود نيز رژيم داروئي شناخته شده اي وجود ندارد.

ميكروسپوريديوز

در مجموع، غير از توجهات كلّي و رعايت موازين بهداشتي و بخصوص شستشوي دست ها اقدام ديگري توصيه نشده است و رژيم داروئي پيشگيرنده موثري وجود ندارد.

کریپتوسپوریدیوم، برای اولین بار توسط  Tyzzer در سال 1907 در مخاط معده موش آزمایشگاهی مشاهده شد. برای 70 سال خصوصیات این تک یاخته به طور کامل معلوم نبود. توجه به این انگل در دو دهه گذشته اقزایش یافته است. این انگل از آنجا که در بیماران نقص سیستم ایمنی، تمایل به ماندگاری دارد، موجب اسهال مزمن در این بیماران می شود و از این نظر مورد توجه محققان قرار گرفته است و مکانیسم پاتوژنز وپاتوفیزیولوژی آن تحت بررسی می باشد.

کریپتوسپوریدیوم، زئنوتیک است و افرادی که با دامها تماس دارند در خطر ابتلا به آن هستند. کودکان با سوء تغذیه نیز در معرض ابتلا به اسهال مزمن با این انگل هستند. عفونت، ماهها و حتي سالها در افراد با نقص اكتسابي سيستم ايمني و يا نقص مادرزادي آن باقي مي‌ماند و حتي مي‌تواند به سمت كبد و صفرا و يا لوله‌هاي پانكراس گسترده شود. کریپتوسپوریدیوم 25% موارد اسهال در دنیا را به خود اختصاص داده است و انگلی جهان شمول است. کریپتوسپوریدیوم، جزء فیلوم اپی کمپلکسا (دارای کمپلکس راسی )، کلاس اسپوروزوئیتها (دارای سیکل زندگی جنسی و غیر جنسی و اووسیست )، زیر کلاس Coccidiasina ( دارای موروگونی و گامتوگونی)  تحت راسته Eimeriina، راسته کوکسیدیاهای حقیقی، از خانواده   Cryptosporidae است.

تا سال 1955 این تک یاخته یک ارگانیسم کامنسال تصور می شد تا اینکه در این سال، عامل انتریت کشنده بوقلمون مشاهده شد. در سال 1971، اولین مورد کلنیکی آن را در گوساله های ایالات متحده آمریکا گزارش کردند. در دهه 1976 اولین اطلاعات در مورد پاتوژنز انسانی کریپتوسپوریدیوم توسط Nime   ، گزارش شد.

95سال پس از پي بردن به بسياري از بيماريهاي روده‌اي، كريپتوسپوريديوم انگلي كه مهره‌داران را آلوده  مي‌كند ، هنوز به صورت معمائي باقي مانده است.

كريپتوسپوريديوم ، انگلي با انتشار جهاني است و بيست گونه از آن در مهره ‌داراني چون پستانداران، پرندگان، خزندگان و ماهيها گزارش شده است. از ميان گونه‌هاي مختلف، كريپتوسپوريديوم پارووم انسان و ساير گونه‌ها را اغلب آلوده مي‌كند. مشخصات مولكولي‌ كريپتوسپوريديوم، باعث تفكيك گونه‌ پارووم به دو بخش شده است، گروهي كه مربوط به انسان مي‌باشد و گروهي كه مربوط به اغلب جانوران است. مكانيسم واكنش كريپتوسپوريديوم با سلولهاي ميزبان هنوز مبهم باقي مانده است. تاكسونومي اين پارازيت مبارزه‌اي جدي را از بين بيولوژيستها و اپي دميولوژيستها در زمينه مولكولي برانگيخته است. مشكل، شناخت فنوتيپ در گونه‌هاي ميزبانان مختلف مي‌باشد (گرچه اين تفاوتها آشكار هستند) و اين در حالي است كه كريپتوسپوريديوم از منابع مختلف بدست آورده مي‌شود. گوسفندان (با 7 گونه حيواني آن) و انسان با اسهالهاي شديد عفوني شدند. اين انتقال بين حيوان و انسان مشخص كرد كه انگل يك زئونوز است، كه باعث اسهال شديد شده است. بر پايه اين مدارك اوليه، نامگذاري گونه كريپتوسپوريديوم صورت گرفت و اين در حالي بود كه آنها هنوز به خوبي شناخته نشده بودند. كريپتوسپوريديوم پارووم مهمترين گونه ايجاد عفونت بادوام درپستانداران است. شمار دقيق گونه‌هاي اضافه شده هنوز معلوم نيست. اما با استفاده از متدهاي مولكولي، دانش ما درباره تاكسونومي  اين گونه افزايش يافته است.

21تفاوت عمومي تاكنون بين گونه‌ها مشخص شده است و در حال حاضر حداقل 6 جنس از كريپتوسپوريديوم شناخته شده‌اند.

هيچ ارگانيسمي مثل كريپتوسپوريديوم، ديواره سلولي را براي ايجاد موقعيت و جايگاه خودش تغيير نمي‌دهد.نه مكانيسمهاي اين پروسه و نه مكانيسمهاي انگل به طور دقيق درك نشده‌اند! اين ويژگي  كريپتوسپوريديوم  را به رازي براي شميوتراپي تبديل كرده است. كريپتوسپوريديوم مثل بقيه كوكسيدياها در خلال رشدش، خودش را درون سلول ميزبان مخفي مي‌كند. اين روند، مكانيسمي براي محافظت انگل از پاسخ سيستم ايمني ميزبان و از محيط روده است و اين در حالي است كه تغذيه و منبع انرژي انگل از ميزبان فراهم مي‌شود (مانند ساير كوكسيدياها).

كريپتوسپوريديوم، در درون سلولهاي ميزبان در يك حفره به نام حفره پارازيتيفوروس قرار مي‌گيرد و مجرايي از سيتوپلاسم ميزبان براي خود فراهم مي‌آورد تا  واردانگل ‌شود و  آن را تغذيه كند. كريپتوسپوريديوم برخلاف هر كوكسيدياي ديگر، يك ساختمان منحصر به فرد به عنوان غشاء تغذيه كننده ارگانل دارد كه مستقيما بين سلول و سيتوپلاسم ميزبان گسترده مي‌شود. تصور مي‌شود كه (PVM) phorous vaculolar membrane  فقط نقش محافظتي را براي آن دارد (در حالي كه غشاء منع تغذيه ارگانل است و جايگاهي براي برداشت انرژي از سلول ميزبان است). همچنين (PVM) نفوذپذيري انتخابي نسبت به بعضي از مواد معين از لومن روده دارد. اين حقيقي است كه PVM مي‌تواند عملكردهاي ديگري نيز براي انگل داشته باشد و اين در حالي است كه PVM معمولا از غشا سلول ميزبان مشتق مي‌شود.

مرگ داخل سلولي كريپتوسپوريديوم پارووم

عوامل ضد ميكروبي به منظور تاثير موثر بر ميكروارگانيسمهاي داخل سلولي بايد وارد سلول شوند و مكانيسم تا از بين بردن انگل ، داخل سلول ميزبان ادامه مي‌يابد.

مكان مخصوص C.parvum زير غشاء سلول يا PVM يا در لومن روده است. اين انگل مستقيما به دومنهاي خارج سلولي دسترسي دارد.

براي تحقيق در باره دارويي كه بتواند مانع انتقال  ‍C.parvum شود، ما بايد از پارومومايسين استفاده كنيم. تنها عامل آنتي ميكروبيال كه به طور جزئي ولي سازگار مي‌تواند اثر بگذارد و از گسترش و رشد انگل در invitro , invivo جلوگيري مي كند. اين مطالعات نشان مي‌دهد كه،  پارومومايسين و جنتيسين ،كه يك آمينوگلي كوزيد ديگر است، مي‌توانند فعاليت رادر invitro مهار كنند.

غشاهايي كه از انگل و حفره پارازيتيوفوروس منشا گرفته‌اند بي‌شك سهم بزرگي در ورود پارومومايسين دارند و امكان دارد پذيراي بقيه داروها هم باشند. اين مشاهدات مي‌تواند براي، تعيين هدف داروها مورد توجه باشد.

پاتوفيزيولوژي

مكانيسم بيماريزايي كه C.parvum ايجاد مي‌كند منجر به اسهال ، سوء جذب vitB12 ، D- گزيلوز و استئاتوره مي‌شود. اين مكانيسمها اولين واكنش انگل و ميزبان از حمله انگل به بافت روده‌اي ميزبان است.

اولين واكنش بعد از ورود انگل به سلول ميزبان اين است كه، عامل تهاجم وحفره پارازيتيفوروس باهم يكي مي‌شوند كه شامل چندين ليگاند و گيرنده براي انگل و رسپتورهاي ميزبان است.

اين واكنش در اپي كمپلكسا مثل توكسوپلاسما همچنين در پلاسموديوم و امريا نيز مطالعه شده است.

مرحله زوئيت غيرتهاجمي شامل رافتيدي و ميكرونم‌ها و گرانولوهاي دنس يا متراكم هستند كه همه جزء كمپكلس‌‍ رأسي مي‌باشند.

در خلال اولين واكنش انگل – ميزبان، اين ارگانها به طور مداوم و پي‌درپي پروتئينهاي اگزوسيتوز را ترشح مي‌كنند كه تهاجم را براي انگل مهيا مي‌كند و همچنين باعث شكل‌گيري واكوئل مي‌شود. بسياري از پروتئينهاي ميكرونمال، مولكولهاي چسبندگي دارند كه انگلهاي گروه اپي كمپلكسا را از صدمه مصون نگه مي‌دارند. به منظور افزايش شناخت كريپتوسپوريديوم به عنوان يك پاتوژن انساني بايد پروتئينها و كمپلكس راسي آن شناخته شود اين پروتئينها شامل:

CSL,GP900,P23/27,TRAPC1,GP15,CP15,GP60,CP47,gp40/45 and gp15/Cp17  ، میباشد.

از مطالعاتي كه در باره اين پروتئينها صورت گرفته است، اين گونه استنباط ميشود كه در بيماريزايي كريپتوسپوريديوم نقش دارند.

پروتئین های موثر در پاتوفیزیولوژی

  CSL: circumsporozoite - like antigen

يك گلي كوزيلات با وزن 1300KD است كه بسيار گلي كوزيله شده است و با استفاده از آنتي‌بادي مونوكلونال كه به آن اپي توپهاي تكراري كربوهيدراتي متصل كرده‌ بودند شناخته شد.

اين mAb دلالت به همان circumspao ziote-like Ag دارند. همچنين اين mAb عفونت را در مدل موشي كريپتوسپوريديوم در ivitro,invitro خنثي كرده است.

CLS، بر روي ميكرونماها و گرانولهاي متراكم  كمپلكس راسي و روي سطح اسپوروزئيت قرار گرفته است.

مطالعات جديد نشان مي‌دهد كه CLS به يك رسپتور KD85 بر روي سلولهاي اپيتليال روده‌اي متصل مي‌شود، هنوزساختار مولكولي اين pro مبهم است. اين بافتها مي‌تواند CSL را به عنوان هدفي براي درمان كريپتوسپوريديوم مطرح كند.

   GP900 Glicoprotein 900

مثل CLS يك گلي كوپروتئين با وزن مولكولي بالاست كه بسيار گلي كوزيله شده است. در ميكرونماي اپي كمپلكسا سنتز مي‌ شود و در سطح زوئيتهاي مهاجم و در خلال حركت آنها به بيرون ترشح مي‌شود. آناليز و تجزيه سكانسهاي آمينواسيد GP900 نشان مي‌دهد كه، يك پروتئين مولتي دومن است كه غني از سيستئين مي‌باشد و دومينهاي شبه موسيني دارد (يك دومن بين غشايي و دم سيتوپلاسمي).

GP900 در سمت Nترمينال، گلي كوزيله شده است. GP900 به سطح سلولهاي اپيتليال روده‌اي متصل مي‌شود. اين مشاهدات نشان مي‌دهد كه GP900، واسطه تهاجم به سلولهاي ميزبان است ارتباط بين CLS,GP900 هنوز به درستي معلوم نيست.

    Thrombos pondin-related adhesive protein(TRAPC1)

پروتئينهاي چسبندگي وابسته به ترومبوسپوندين، هومولوگي از پروتئينهاي ميكرونمال است كه شامل TRAP, CTRP, CS, Etp100  and  MIC-2 مي‌باشند.

اين پروتئينها يك دومين ترومبوسپونديني دارند و به وسيله ترومبوسپوندين مولتي پل وابسته به موتيفها نشان داده شده‌اند و به طور قطع براي درمان سلولهاي ميزبان اهميت دارند.

محصول سكانس آمينواسيدهاي TRAPC1 يك سكانس Nترمينالي است كه يك دومين پلي‌سرين است، يك دومن ترومبوسپونديني نيز دارد، يك دومن بين غشايي و يك دم سيتوپلاسمي است. با استفاده ازآنتي‌باديهاي نوتركيب شده، TRAPC1 را لوكاليزه مي‌كنند، هنوز هيچ شواهدي از درگيري TRAPC1 در  تهاجم انگل به سلولهاي ميزبان ديده نشده است.

   gp40

تحقيقات بيشتر ما را به سمت gp40 مي‌برد، يك گلي‌كوپروتئين O-گلي كوزيله شده شبه موسيني ديگر، كه در مرحله تهاجم انگل به سلولهاي ميزبان، بر روي سطح منطقه راسي قرار دارد و از سطح پارازيت بيرون ريخته مي‌شود. آنتي‌باديهاي اختصاصي ضد gp40 عفونت را در invitro خنثي مي‌كنند. Gp40 در C.parvum، به طور اختصاصي به سلولهاي ميزبان باند مي‌شود تصور مي‌شود كه اين پروتئين در چسبندگي و تهاجم نقش داشته باشد. كلون كردن ژن gp40 در  C.parvum. آناليز آمينواسيدهاي آن يك سيگنال پپتيد N- ترمينالي و يك دومين پلي سريني را نشان داد.

·       CPgp40/15

يك ايمنودمن 15/17KD را كد مي‌كند كه در واكنش انگل ميزبان دخيل است و در مرحله تهاجم در سطح انگل قرار داد.

در حال حاضر gp15,gp40 با مرحله بعد از ترجمه پروكوسور گلي‌كوپروتئيني، از هم مشتق مي‌شوند كه به وسيله Gp40/15 در مراحل خارج سلولي انگل كد مي‌شوند gp40، قطعه N ترمينال محلول و gp15، C- ترمينال پروكورسور gp40/15 هستند كه در خلال مراحل بعد از ترجمه به صورت واحد باقي مي‌مانند.

    CP47

يك پروتئين غشايي است، كه به سطح سلولهاي اپيتليال روده‌اي باند مي‌شود و در قسمت راسي اسپوروزئيت است. هنوز ژني كه CP47 را كد مي‌كند كلون نشده است.

با توجه به قرائن اينطور استنباط مي‌شود كه پروتئينهاي كه توضيح داده شد هم در درمان و هم در تهاجم انگل مي‌توانند دخيل باشد.

كريپتوسپوريديوز در مبتلایان به ایدز

كريپتوسپوريديوز، يكي از عفونتهاي فرصت طلب شايع در ميان مبتلايان به AIDS است. شمارش سلولهاي لنفوسيتي T4 در در خلال رشد انگل و سيكل زندگي آن در اين افراد به كمتر از ml/150 مي‌رسد.

عفونت، ماهها و حتي سالها در افراد با نقص اكتسابي سيستم ايمني و يا نقص مادرزادي آن باقي مي‌ماند و حتي مي‌تواند به سمت كبد و صفرا و يا لوله‌هاي پانكراس گسترده شود كه باعث Choledochitis , cholecystitis , cholangio hepatitis يا pancreatitis مي‌شود. تلاش محققان برای یافتن درمان موثر و یا واکسن مخصوص كريپتوسپوريديوم ادامه دارد.

عدهای از محققان در اواسط دهه 1990 درهند، شیوع اسهال كريپتوسپوريدیایی را در مبتلایان به ایدز بررسی کردند. بررسیهای آنان نشان داد که: اسهال كريپتوسپوريدیایی در 7% تا 83% از بیماران با علائم و در 4/1% تا 57%  بدون علائم است. درصدهای مشابهی نیز از شمال شرقی آمریکا گزارش سده است. در بررسی با متدهای پیشرفته ای مانند Molecular tools و در بررسیهای اپیدمیولوژیک معلوم شده است که مبتلایان به ایدز( بالغین و کودکان)، مستعد آلودگی با گونه های مختلف كريپتوسپوريدیوم هستند.البته شيوع اين بيماري در مبتلايان به ايدز خيلي بالا نيست (15%-5 در كشورهاي توسعه يافته).

فقدان راههاي مناسب درماني براي اين انگل آنرا به يك مشكل در ميان عفونتهاي فرصت طلب كه با ايدز ديده مي‌شوند، تبديل كرده است.

كريپتوسپوريديوز در كودكان با سوء تغذيه

چندين گزارش نشان مي‌دهد كه اسهال كريپتوسپوريديايي در كودكان با سوء تغذيه تمايل به ماندگاري دارد. در مطالعه ای محققان 1779 کودک با اسهال را بررسی کردند. 444 کودک، علت اسهالشان كريپتوسپوريدیوم پارووم بود. آنالیز PCR  بر روی 444 نمونه استول این کودکان نشان می داد که 74% با تیپ 1 انسانی آلوده شده اند و 19% با تیپ 2 ، 6% آلودگیها نیز مخلوطی از هر دو تیپ بود، آنان در یافتند که در کودکان با سوء تغذیه اسهال پایدار شیوع بیشتری دارد (31%) و 22% از کودکان نیز اسهال حاد داشتند.  كريپتوسپوريدیوز در کودکان ایرانی نیز بررسی شده است. تحقیقاتی در بین می 2003 تا اکتبر 2003 در 614 کودک با علائم و بدون علائم در کلنیک کودکان در کرمانشاه، صورت گرفت. پژوهشگران از هر  515 کودک با علائم  یک نمونه استول گرفتند و از هر99 کودک بدون علائم نیز یک نمونه گرفتند. بعد از تهیه اسمیر از نمونه ها  آنها را با متد ذیل نلسون اصلاح شده رنگ کردند.در  4/10 % از نمونه ها C.parvum یافتند. درصد آلودگی با C.parvum ، به طور مشخصی در کودکان با اسهال  نمودار بود. آنها در   2/ 15% از کودکانی که در روستا زندگی می کردند و در  2/ 7 %  از کودکانی که در مناطق شهری بودند C.parvum را یافتند.درصد آلودگی با C.parvum در کودکانی که با حیوانات تماس داشتند  5/8 %  بود. این درصد در کودکانی که با  حیوانات تماس ندارند به  2/ 6% می رسد. مشکل ایجاد اسهال پایدار، دهیدراتاسیون و سوء جذب در این کودکان است.

در خلال 15ماه مطالعه در بيمارستان مالگو در كامپالا، از 13556 نفري كه از بچه‌ها اسهال داشتند، 200 كودك وضعيت حادي داشتند.

در ميان 1779 كودك بيمار 9/29% كه اسهال در آنها بيشتر از 14 روز طول كشيد، در گروه اسهال مزمن قرار گرفتند. از 1779  كودك با اسهال در حدود 40% آن دچار دهيدراتاسيون شده بودند.

مطالعات عده‌اي از محققين نشان داده است كه: ارتباطي قوي‌، بين سن و ايجاد شدن اسهال وجود دارد. تقريبا 25% بچه‌ها در کودکی براي اولين بار دچار عفونت مي‌شوند.

آپوپتوز

براي بررسي ارتباط بين اين انگل و آپپتوز، در ابتدا بهتر است پديده آپوپتوز را بررسي كنيم.

آپوپتوز تحت كنترل ژنتيك است. در هسته سلول اتفاق مي‌افتد و هسته سلول را آرام آرام جمع مي‌كند مهمترين ويژگي آپوپتوز اين است كه ديواره از بين نمي‌رود و پروتئوليز، در داخل سلول آرام آرام اتفاق مي‌افتد.

نكروز، يك عارضه پاتولوژيك است.در نكروز سوراخ روي ديواره سلول ايجاد مي‌شود. سلول متورم مي‌شود و سرانجام محتويات سلول خارج مي‌شود.

بعد از سالها، دانشمندان دريافتند آپوپتوز در تك سلوليها هم اتفاق مي‌افتد. در اين روند، 2 مسير داريم: مسير داخلي و مسير خارجي.

در مسير داخلي، ميتوز نقش مهمي دارد. آنزيمهايي كه در مرگ سلول نقش دارند و در ميتوز هم مهمند، فعال مي‌شوند. هر نوع آسيبي به DNA منجر به خارج شدن سيتوكروم C از انگل يا متازوآ مي‌شود، سيتوكروم C روي آنزيمها اثر مي‌كند كه مهمترين اين آنزيمها، كاسپاز است. در اثر فعال شدن كاسپاز مسير به صورت آبشاري تا خرد شدن DNA و پروتئوليز پروتئينها پيش مي‌رود.در مسير خارج سلولي نيز فعال شدن كاسپاز رخ مي‌دهد.

كاسپاز، آنزيم اصلي در القاء مرگ سلولي است. بعدها هومولوگي به جاي كاسپاز به نام متاكاسپاز را شناسايي و معرفي كردند. نام كاسپاز از سيستئين آسپارتيك اسيد پروتئاز گرفته شده است.

القاء آپوپتوز در سلولهاي روده‌اي به وسيله C.parvum

كريپتوسپوريديوم پارووم، عامل اسهال در ميزبان با نقص ايمني و در ميزبان با سيستم ايمني كار آمد است. سايت اول C.parvum  اپيتليوم سلولهاي روده‌اي است، علاوه بر اين مجاري هوايي، شكم يا كيسه صفراء نيز مي‌تواند عفوني شوند. مرحله تهاجم انگل اووسيست است كه معمولا 4 اسپوروزوئيت را دارد. به دنبال پاره شدن آن،اسپوروزئيت به روده حمله مي‌كند و از طريق قسمت راسي خود گسترش مي‌يابند. C.parvum  در 48ساعت اوليه در كشت سلول و در invitro سيكل غيرجنسي خود را از سر مي‌گذراند. C.parvum باعث كوتاه شدن ويلي‌ها، هايپرپلازي كريپتها، و تغيير دادن پروتئينهاي ستيواسكتال مي‌شود و جذب سديم را هم تغيير مي‌دهد.

همچنين باعث افزايش محصولات پروستاگلايدين مي‌شود و كموكاينهاي اپتليال را براي ترشح تحريك مي‌كند.

ناحيه‌اي راسي C.parvum باعث آزاد شدن آنزيم سيتوليكي-لاكتات دهيدروژناز مي‌شود. اما هنوز نقش دقيق اين فاكتور شناسايي نشده است.

آپوپتوز، يك روند برنامه‌ريزي شده از مرگ سلول است كه مي‌تواند به وسيله عوامل محيطي يا سلولهاي مجاور و ديگر رخ دهد، كه با نكروز سلولهاي اپيتليال فرق مي‌كند.

آپپتوز مي‌تواند در خلال ابتلا به چندين عفونت مهاجم يا غير مهاجم در بيماريهاي روده‌اي انسان رخ بدهد، مثل گونه‌هاي سالمونلا و شيگلا، در E.coli و يا ويروس نقص سيستم ايمني تيپ1، و هليكوباكترپيلوري.

يافته‌هاي محققين نشان داد كه در حضور فعاليت فاكتو ر  NF-κβ، آپوپپتوز سلولهاي اپي‌تليال روده محدود مي‌شود و زماني كه فعاليت NF-κβ بلوكه مي‌شود، ظرفيت آپوپتوز به طور بارزي افزايش مي‌يابد. اينكه آمادگي سلولها در اين حالت براي آپتوپوز بيشتر شده بود جالب توجه بود. عده‌اي ديگر از محققين دريافتند كه پاتوژنهايي مانند توكسو پلاسما گوندي و كلاميديا ترايكومايتيس، با سلولهاي آلوده به C.parvum رقابت مي‌كنند و روند آپوپتوز را كاهش مي‌دهد. محققين دريافتند كه آپپتوز  با درجات متوسطي به وسيله C.parvum در سلول القاء مي‌شود كه اين روند به رشد سلولهاي اپي‌تليال نيز بستگي داشت و دريافتند كه آپوپتوز و نكروز مي‌تواند توسط سيستم ايمني ميزبان محدود شود و حذف سلولهاي آلوده شايد به نفع ميزبان و محدود شدن واكنشهاي التهابي ميزبان باشد.

عده‌اي ديگر از محققين اين تحقيقات را بر روي مدل شي، نيز انجام دادند. يافته هاي آنان، نشان داد كه زماني كه   C.parvum وارد سلول مي‌شود، اپي تليال ايلئوم كاهش مي‌يابد. ويلي‌ها كوتاه و ضخيم مي‌شوند و آپپتوز كمي هم مشاهده شد. اين يافته‌ها نشان مي‌دهد كه آپوپتوز يكي از مشخصه‌هاي عفونت با C.parvum است.

محققين براي اين پژوهش ،10موش 7 روزه انتخاب كردند و آنها را در معرض آلودگي با C.parvum قرار دارند. بعد از گذشت زمان cm1 از انتهاي ايلئوم هر كدام را برداشت كردند و آنرا با فرمالين 10% فيكس كردند و براي برش در پارافين قرار دادند. در بعضي از موشها دئودنوم و كلون را نيز برداشت كردند برشها را با رنگ‌آميزي هماتوكسيلين- ائوزين رنگ آميزي كردند. برشها را زير يك ميكروسكوپ نوري مورد بررسي قرار گرفت، طول ويلي‌هاي روده را به وسيله يك ميكرومتر چشمي در يك ميكروسكوپ نوري بدست آوردند. بعد از 7 روز تعداد اووسيستهاي C.parvum به حداكثر رسيده بود. گرچه وزن موشها بعد از 7 روز عوض نشده بود يا علائم اسهال شديد را نشان ندادند. رنگ‌آميزي H&E گرانولهاي ائوزينوفيليكي كه رنگ را به خود جذب كرده بودند نشان مي‌داد و همچنين سلولهاي گابلت در تمام موشهاي آلوده كاهش يافته‌ها بودند. يافتهای آنان  نشان داد كه عفونت با C.parvum مي‌تواند به تغيير ساختار اپي‌تليوم ايلئوم و تغيير عناصر ساختار سلولي منجر بشود. اين تغييرات منجر به تغيير عملكرد روده و همچنين سوء جذب vitB12  نيز مي‌شود.

همچنين گزارش شده است كه پروتئين نوتركيب TAT در HIV مي‌تواند آپپتوز را به وسيله C.parvum افزايش بدهد.

با توجه به تمام يافته‌ها مكانيسم دقيق بيماري‌زايي درC.parvum مبهم باقي مانده است. 

پاسخ سیستم ایمنی انسان به   C.parvum

پاسخ سیستم ایمنی به انگل ذاتی واکتسابی است . فعالیت NFκβ منجر به آزاد شدن کموکاینها می شود. در لاین سلولهای روده ای در invitro آزاد شدن CXCL-8 در خلال عفونت با C.parvum مشاهده شده است. در مطالعه ای در برزیل محققان دریافتند که در استول کودکان بیشترIL-8 یافت می شود. در آنالیز بافت روده  مبتلایان به ایدز CXCL-8 یافت نشده است. CCL5 نیز بعد از عفونت، در روده حضور می یابد. میزان این کموکاین در افراد با سیستم ایمنی کار آمد در مقایسه با بیماران نقص سیستم ایمنی تفاوتی ندارد.

در ابتداء کموکاینهایی مانند CXCL-10 و شاید CXCL-8 به عنوان کموتاکسی برای گرانولوسیتها عمل میکنند. فعالیت IL-15 نیز در ابتدای عفونت مورد توجه است. نقش کلیدی را Tcell CD4 و  γIFN ایفا می کند. پاسخ التهابی بدن به انگل، موجب اسهال می شود و شاید TNF-β  و IL-10 نقش ضد التهابی داشته باشند و باعث بروز IgA در مخاط روده می شوند، از این طریق از عفونت مجدد نیز جلوگیری می شود.

برگرفته از سایت:

http://parasitology.blogfa.com/post-30.aspx

A course on parasitology in English by Fred R. Opperdoes

Research Unit for Tropical Diseases,"Christian de Duve" Institute of Cellular Pathology and Laboratory of Biochemistry, Université Catholique de Louvain, Avenue Hippocrate 74-75, B-1200 Brussels, Belgium

Table of contents

• Definitions and concepts
  • Definition of parasitism
  • Parasitic associations
  • What is parasitology
  • Different types of parasites
  • Mechanisms of infection
  • Types of parasite 2
  • Types of host and vector
  • Parasite reservoirs
  • How do parasites survive inside an immunocompetent host ?
  • Harmful effects of the parasite on the host
  • Prophylaxis
• Trypanosomiases
  • African trypanosomiasis or sleeping sickness
    • Trypanosoma brucei as the model organism
    • Diagnosis and treatment
    • Drugs
    • Tsetse traps
    • Fact sheet on sleeping sickness in the soudan
  • American trypanosomiasis or Chagas' disease
    • Symptoms and Pathology
    • Immunity
    • Treatment
    • Chagas' press release
    • Interruption of transmission (press release)
    • Uruguay free of transmission
• Leishmaniasis
  • Immunity
  • Parasite and host cell
  • Different manifestation of the disease
  • Treatment
  • Survival of parasites in the macrophage
  • Oxygen defense mechanisms
  • Mode of action of anti-trypanosomatid drugs
  • Anti-leishmania vaccines
  • Leishmaniasis and AIDS
• Malaria
  • The four Plasmodium species
  • The Plasmodium life cycle
  • Immunity
  • Clinical manifestations
  • Vaccine development
  • Chemotherapy
    • Mode of action of anti-malarials
    • Drug resistance
    • Novel drugs
      • Artesunate
      • Pyronaridine
  • Prophylaxis
  • Plastids in the Apicomplexans
  • The WHO malaria fact sheet
  • Visit an interesting website on malaria
• Babesiosis
  • Hosts and vectors
  • Life cycle
  • Cattle babesiosis
  • Human babesiosis
• Theileriosis
• Schistosomiasis
• Lymphatic filariasis
• Onchocerciasis or river blindness
  

  ---

• Questions
• Terms

Toxoplasma Gondii

J. P. Dubey

General Concepts

Clinical Manifestations

Infection is often asymptomatic. Immunocompetent individuals may present with fever, lymphadenopathy, muscle aches, and headache. Congenitally infected children may suffer impaired vision and mental retardation. Immunosuppressed patients may have central nervous system disease (encephalitis).

Structure and Life Cycle

Members of the cat family (Felidae) are the definitive hosts; many mammals and birds serve as intermediate hosts. Infection is contracted by ingesting either oocysts or meat containing live organisms. Organisms enter the intestinal epithelium and can spread to many host tissues. Individual organisms are lunate, about 6 X 2 µm, and multiply within host cells. Tissue cysts containing hundreds of quiescent organisms may form as infection wanes. Toxoplasma reproduces sexually only in cats. Organisms infecting the intestinal epithelium produce oocysts which are shed in the feces. Mature oocysts are approximately 12 µm in diameter and contain eight infective sporozoites.

Classification and Antigenic Types

Toxoplasma gondii, a member of the Apicomplexa, is the sole species.

Multiplication and Life Cycle

A sexual multiplication by cell division can occur in virtually any host cell.

Pathogenesis

Host cells are destroyed by active multiplication of T gondii. Necrotic foci may result. Congenital infection often involves the retina and brain; focal chorioretinitis may result in impaired vision. Brain involvement in immunosuppressed patients may lead to large necrotic abscesses. Disease reactivation in immunosuppressed patients may result from the rupture of a tissue cyst.

Host Defenses

Immunocompetent individuals mount an effective cell mediated immune response that eradicates active infection within weeks or months and results in immunity against reinfection. Tissue cysts are unreactive and may persist for the life of the host.

Epidemiology

Toxoplasmosis shows a nonseasonal worldwide distribution. Most natural infections are acquired by ingesting undercooked meat containing tissue cysts or food contaminated by cat feces.

Diagnosis

Diagnosis is based on serology and on histologic examination of tissues.

Control

Infection may be prevented by thorough cooking of meat and by proper management of cats. Acute cases are treated with sulfadiazine and pyrimethamine.

INTRODUCTION

Toxoplasma gondii is an intestinal coccidium that parasitizes members of the cat family as definitive hosts and has a wide range of intermediate hosts. Infection is common in many warm-blooded animals, including humans. In most cases infection is asymptomatic, but devastating disease can occur.

Clinical Manifestations

Toxoplasma gondii usually parasitizes both definitive and intermediate hosts without producing clinical signs. In humans, severe disease is usually observed only in congenitally infected children and in immunosuppressed individuals, including patients with acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Postnatally acquired infections may be local or generalized and are rarely severe in immunocompetent individuals. Lymphadenitis is the most common manifestation in humans. Any node can be infected, but the deep cervical nodes are the most commonly involved. Infected nodes are tender and discrete but not painful; the infection resolves spontaneously in weeks or months. Lymphadenopathy may be accompanied by fever, malaise, fatigue, muscle pains, sore throat, and headache.

Encephalitis is an important and severe manifestation of toxoplasmosis in immunosuppressed patients including patients with AIDS. Symptoms may include headache, disorientation, drowsiness, hemiparesis, reflex changes, and convulsions. Coma and death may ensue.

Prenatally acquired T gondii often infects the brain and retina and can cause a wide spectrum of clinical disease. Mild disease may consist of slightly diminished vision, whereas severely diseased children may exhibit a classic tetrad of signs: retinochoroiditis, hydrocephalus, convulsions, and intracerebral calcifications. Hydrocephalus is the least common but most dramatic lesion of congenital toxoplasmosis (Fig. 1). Ocular disease is the most common sequela.

FIGURE 84-1 Girl with hydrocephalus due to congenital toxoplasmosis. (From Dubey JP, and Beattie CP. Toxoplasmosis of animals and Man. CRC Press, Baca Raton, Florida, 52, 1988.)

Toxoplasma gondii is capable of causing severe disease in animals other than humans. It is one of the major causes of abortion in sheep and goats in many countries, including Australia and the United States. It is important to diagnose toxoplasmic abortion to distinguish it from other causes of abortion, because congenital transmission of T gondii occurs only during the initial infection of the mother and the animal is safe for breeding thereafter. Cats, dogs, and many other pets can die of pneumonia, hepatitis, and encephalitis due to toxoplasmosis. In dogs, clinical toxoplasmosis is often associated with concurrent distemper virus infection. Certain species of marsupials and New World monkeys are highly susceptible to toxoplasmosis.

Structure, Multiplication, and Life Cycle

The life cycle of T gondii was described only in 1970, when it was discovered that the definitive hosts are members of the family Felidae, including domestic cats. Various warm-blooded animals serve as intermediate hosts. Toxoplasma gondii is transmitted by three known modes: congenitally, through the consumption of uncooked infected meat, and via fecal matter. Figure 2 shows the life cycle of T gondii.

Figure 84-2 Life cycle of Toxoplasma gondii. Cats, the definitive hosts of T gondii, can become infected by ingesting sporulated oocysts or (most often) infected animals. The oocysts are infectious to most mammals and birds. Toxoplasma can be transmitted to intermediate hosts through oocysts, by carnivorism, or transplacentally. Transplacental transmission is most important in humans and sheep. (From Dubey JP, Toxoplasmosis. J Am Vet Med Assoc 189:166, 1986.)

Cats acquire Toxoplasma by ingesting any of three infectious stages of the organism: the rapidly multiplying forms called tachyzoites (Fig. 3), the quiescent bradyzoites that occupy cysts in infected tissue (Fig. 4), and the oocysts shed in feces (Fig. 5). Successful infection of the cat is revealed by the shedding of oocysts in the feces. The chance of infection and the prepatent period (the time between infection and the shedding of oocysts) varies with the stage of T gondii ingested. Fewer than 50 percent of cats shed oocysts after ingesting tachyzoites or oocysts, whereas nearly all cats shed oocysts after ingesting tissue cysts. Only the cyst-induced cycle has been studied in detail.

FIGURE 84-3 Tachyzoites of T gondii.

A. Extracellular (arrow) released from host cells. Compare their size with red blood cells and a lymphocyte. Impression smear, Giemsa stain. Bar = 20 µm.

B. Intracellular in cell culture. Note a group arranged in a rosette (arrow) and vacuole (arrowhead) around a tachyzoite. Immunohistochemical stain with a tachyzoite-specific monoclonal antibody. Bar = 20 µm.

C. Transmission electron micrograph of an intracellular tachyzoite. Note a parasitophorous vacuole (PV) around the tachyzoite. Parasite organelles visible in this picture include a conoid (c), micronemes (m), dense granules (dg) nucleus (n) and rhoptries (r). Bar=0.8 µm. (Courtesy of Dr. D.S. Lindsay, Auburn University, AL.)

FIGURE 84-4 Tissue cysts of T gondii.

A. Tissue cyst freed from mouse brain. Note a thin (arrow) cyst wall enclosing hundreds of bradyzoites. Unstrained. Bar = 20 µm.

B. Two tissue cysts (arrows) in section of brain. Hematoxylin and eosin stain. Bar = 20 µm.

C. Transmission electron micrograph of a small tissue cyst in cell culture. Note thin cyst wall (arrow) enclosing 6 bradyzoites (arrowheads). Bar = 1.0 µm. (Courtesy of Dr. D.S. Lindsay, Auburn University, Auburn, AL.)

When a cat ingests meat containing tissue cysts, the cyst wall is dissolved by the proteolytic enzymes in the stomach and small intestine, releasing the bradyzoites. The bradyzoites, which are a slow multiplying stage, penetrate the epithelial cells of the small intestine and initiate the formation of numerous asexual generations before the sexual cycle (gametogony, the production of gametes) begins (Fig. 5A). After the male gamete (Fig. 5B) fertilizes the female gamete, two walls are laid down around the fertilized zygote to form the oocyst, which is excreted in the feces in an unsporulated stage (Fig. 5C).

FIGURE 84-5 Sexual states of T gondii

A. Schizonts (double arrowheads), female gamonts (arrows), and male gamonts (arrowheads) in section of superficial epithelial cells of the small intestine of a cats. Hematoxylin and eosin stain. Bar = 15 µm.

B. Three male gametes each with 2 flagella (arrowheads) compared with a merozoite (arrow). Impression of intestinal epithelium of a cat. Giemsa stain. Bar = 10 µm.

C. Unsporulated oocytes (arrowheads) in feces of a cat. Note 2 oocysts of another feline coccidium, Isospora felis (arrowheads). Isospora felis sporulates faster than T gondii. The oocysts on top of the picture already contains 2 sporocysts while all T gondii oocysts are unsporulated. Unstained. Bar - 65 µm.

D. Transmission electron micrograph of a sporulated oocyst. Note thin oocyst wall (arrow), 2 sporocysts (arrowheads) and 4 sporozoites (double arrowheads) in sporocysts. Bar - 2.25 µm. (Courtesy of Dr. D.S. Lindsay, Auburn University, Auburn, AL.)

Oocysts measure approximately 10 by 12 µm. Sporulation occurs outside the body, and the oocyst becomes infectious 1 to 5 days after excretion. Each sporulated oocyst contains two sporocysts and each sporocyst contains four sporozoites (Fig. 5D). Sporulated oocysts are remarkably resistant and can survive in soil for several months.

At the same time that some bradyzoites enter the surface epithelial cells of the feline intestine and multiply there to produce oocysts, other bradyzoites penetrate the lamina propria and begin to multiply as tachyzoites. Tachyzoites are about 6 X 2 µm in size and generally lunate (Fig. 3A). Within a few hours of infection, tachyzoites may disseminate to extraintestinal tissues through the lymph and blood. Tachyzoites can enter almost any type of host cell (Fig. 3C) and multiply until the host cell is filled with parasites and dies (Fig. 3B). The released tachyzoites enter new host cells and multiply. This cycle may result in microfoci of tissue necrosis. The host usually overcomes this phase of infection, and the parasite then enters the "resting" stage in which bradyzoites are isolated in tissue cysts. Tissue cysts are formed most commonly in the brain, liver, and muscles. Cysts in neural tissues are up to 60 µm in diameter and contain hundreds of bradyzoites in a thin membrane (Fig. 4). Tissue cysts usually cause no host reaction and may remain for the life of the host.

In nonfeline intermediate hosts, such as humans or mice, the extraintestinal cycle of T gondii is similar to the cycle in cats. However, sexual stages are produced only in the feline definitive hosts.

Pathogenesis

Most cases of toxoplasmosis in humans are probably acquired by the ingestion of either tissue cysts in infected meat or oocysts in food contaminated with cat feces. Bradyzoites from the tissue cysts or sporozoites released from oocysts penetrate the intestinal epithelial cells and multiply in the intestine. Toxoplasma gondii may spread both locally to mesenteric lymph nodes and to distant organs by invading the lymphatics and blood. Necrosis in intestinal and mesenteric lymph nodes may occur before other organs become severely damaged. Focal areas of necrosis may develop in many organs. The clinical picture is determined by the extent of injury to these organs, especially to vital and vulnerable organs such as the eye, heart, and adrenals. Toxoplasma gondii does not produce a toxin; necrosis is caused by intracellular multiplication of tachyzoites.

Opportunistic toxoplasmosis in AIDS patients usually represents reactivation of chronic infection. The predominant lesion of toxoplasmosis - encephalitis in these patients is necrosis, which often results in multiple abscesses, some as large as a tennis ball (Fig. 6).

FIGURE 84-6 Section of brain from an AIDS patient with fatal toxoplasmosis. Note a large focus of necrosis, 2 tissue cysts (arrows) and numerous tachyzoites (arrowheads - all black dots are tachyzoites). Immunohistochemical stain with anti-T gondii serum Bar - 100 µm.

Host Defenses

The host may die from toxoplasmosis but much more often recovers and acquires immunity. Inflammation usually follows necrosis. By about the third week after infection, Toxoplasma gondii tachyzoites begin to disappear from visceral tissues and may localize as tissue cysts in neural and muscular tissues. Toxoplasma tachyzoites may persist longer in the spinal cord and brain because immune responses are less effective in these organs. Chronic infections may be reactivated locally (for example, in the eye). Reactivation possibly results from the rupture of a tissue cyst. Probably tissue cysts rupture periodically during the life of the host, and the bradyzoites released are normally destroyed by the host's immune responses. This reaction may cause local necrosis accompanied by inflammation. Hypersensitivity is said to play a major role in such reactions; however, in immunocompetent hosts the infection usually subsides, with no local renewed multiplication of Toxoplasma. In immunosuppressed patients, rupture of a tissue cyst may result in renewed multiplication of bradyzoites into tachyzoites, and the host may die from toxoplasmosis. The cause of cyst rupture is not known. Chronic latent T gondii infection can be experimentally reactivated by excessive doses of corticosteroids, antilymphocyte serum and other immunosuppressive therapies.

Epidemiology

Toxoplasma gondii infection in humans is widespread throughout the world. Approximately half a billion humans have antibodies to T gondii. The incidence of infection in humans and animals may vary in different parts of a country. The cause for these variations is not yet known: environmental conditions, cultural habits, and animal species are among factors that may determine the degree of natural spread of Toxoplasma gondii. Only a small proportion (less than 0.1 percent) of people acquire infection congenitally. Immunocompetent mothers of congenitally infected children do not give birth to infected children in subsequent pregnancies. However, repeated congenital infection can occur in mice, rats, guinea pigs, and hamsters without reinfection from outside sources.

The relative frequency with which postnatal toxoplasmosis is acquired by eating raw meat and by ingesting food contaminated by oocysts from cat feces is unknown and difficult to investigate. Both modes of infection are reported to cause clinical toxoplasmosis. Toxoplasma gondii infection occurs commonly in many animals used for food (for example, sheep, goats, pigs, and rabbits). Infection is less prevalent in cattle than in sheep or pigs.

Oocysts are shed by cats - not only the domestic cat - but also other felids such as ocelots, margays, jaguarundi, bobcats, Pallas cats, and Bengal tigers. However, oocyst formation is greatest in the domestic cat. Widespread natural infection is possible because a cat may excrete millions of oocysts after ingesting few tissue cysts. Oocysts are resistant to most ordinary environmental conditions and can survive in moist conditions for months and even years. Invertebrates such as flies, cockroaches, and earthworms can spread oocysts mechanically.

Only a few cats may be involved at any one time in spreading T gondii in an area: at any given time as little as 1 percent of the domestic cat population in the United States is shedding oocysts. It is not known whether cats shed oocysts only once or several times in nature. Under experimental conditions, cats usually do not shed oocysts after reinoculation with T gondii tissue cysts, but this immunity to T gondii in cats does wane with time.

Diagnosis

Diagnosis of toxoplasmosis can be aided by serologic or histocytologic examination. Clinical signs of toxoplasmosis are nonspecific and cannot be depended on for a definite diagnosis; toxoplasmosis clinically mimics several other infectious diseases.

Many serologic tests have been used to detect antibodies to T gondii. The most reliable of these is the Sabin-Feldman dye test. Live virulent tachyzoites of T gondii are used as antigen and are exposed to dilutions of the test serum and to a complement accessory factor resembling complement that is obtained from Toxoplasma-antibody free-human serum. This test is sensitive and so far is the most specific test for toxoplasmosis. Its main disadvantages are its high cost and the human hazard of using live organisms.

The indirect fluorescent antibody test (IFAT) overcomes some of the disadvantages of the dye test. In IFAT, killed tachyzoites of Toxoplasma, which are available commercially, are used as antigen. Titers obtained by IFAT are similar to those from the dye test. Disadvantages of the IFAT are that a microscope with UV light is needed, fluorescent anti-species globulin is required for each species to be tested, and false-positive titers may occur in hosts with anti-nuclear antibodies. The suitability of IFAT in animal diagnostic work is therefore limited, but it has proved useful in diagnosing acquired human toxoplasmosis. Other serologic tests including the indirect hemagglutination test, the latex agglutination test, modified agglutination test, and the enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA), offer some advantages. For example, agglutination tests are easy to perform.

Soluble antigens used for indirect hemagglutination tests are now commercially available in several countries, including the United States. Although this test is easy to perform, it usually does not detect antibodies during the acute phase of toxoplasmosis. In the modified agglutination test, whole killed tachyzoites are used as antigen, and the test serum is treated with 2-mercaptoethanol to eliminate nonspecific agglutinins. The ELISA test using soluble antigens appears to be specific and may become the standard test in the future.

A single positive serum sample proves only that the host has been infected at some time in the past. Serologic evidence for an acute acquired infection is obtained when antibody titers rise by a factor of 4 to 16 in serum taken 2 to 4 weeks after the initial serum collection, or when specific IgM antibody is detected. The finding of antibody in even undiluted serum is useful in the diagnosis of ocular toxoplasmosis because patients with this disorder usually have low T gondii antibody titers.

Diagnosis can be made by finding T gondii in host tissue removed by biopsy or at necropsy. This procedure is particularly useful in immunosuppressed patients or patients with AIDS, in whom antibody synthesis may be delayed and low. Toxoplasma gondii infection can be rapidly diagnosed by making impression smears of lesions on glass slides. After drying for 10 to 30 minutes, the smears are fixed in methyl alcohol and stained with Giemsa stain. Well-preserved T gondii organisms are crescent-shaped and stain well with any of the Romanowsky stains (Fig. 3A); however, degenerating organisms common in lesions usually appear oval and have cytoplasm that stains poorly compared to the nucleus. A diagnosis of toxoplasmosis should not be made unless organisms with the typical structure are seen, as degenerating host cells may resemble degenerating T gondii parasites. In thin sections the tachyzoites are oval to round and usually do not stain differently from host cells. Tissue cysts are occasionally encountered in areas with lesions (Fig. 4B). Tissue cysts are usually spherical and have silver-positive walls; the bradyzoites stain strongly with periodic acidSchiff stain. Immunohistochemical staining and polymerase chain reaction (PCR) can be used to identify T gondii tissue cysts or tachyzoites in tissues, even those fixed in formalin. Electron-micrographic examination can aid in diagnosis (Fig. 3C). Computed tomography techniques are also useful in the diagnosis of human cerebral toxoplasmosis. Inoculation of biopsy materials into laboratory mice and/or cell cultures can help diagnosis.

Control

Sulfonamides and pyrimethamine (Daraprim) are two drugs widely used to treat toxoplasmosis in humans. They act synergistically by blocking the metabolic pathway involving p-aminobenzoic acid and the folic-folinic acid cycle, respectively. These two drugs usually are well tolerated by the patient, but sometimes thrombocytopenia, leukopenia, or both may develop. These effects can be overcome without interrupting treatment by administering folinic acid and yeast because the vertebrate host can utilize presynthesized folinic acid, whereas T gondii cannot. The commonly used sulfonamides, sulfadiazine, sulfamethazine, and sulfamerazine, are all effective against toxoplasmosis. Generally, any sulfonamide that diffuses across the host cell membrane is useful in antitoxoplasmid therapy. Although these drugs are helpful when given in the acute stage of the disease, usually they will not eradicate infection when active multiplication of the parasite occurs. Because sulfa compounds are excreted within a few hours of administration, they must be administered in daily divided doses. Spiramycin, a drug used in France to treat pregnant women to minimize the effects of congenital toxoplasmosis, is not approved for toxoplasmosis in the United States. As yet, there are no effective drugs to kill tissue cysts.

No killed vaccine is currently available to reduce or prevent congenital infections in humans and animals, but research to develop such an agent is under way. A live vaccine using a nonpersistent T gondii strain is available in Europe and New Zealand to reduce abortion in sheep.

To prevent T gondii infection, several precautions should be taken. Meat should be cooked to 66°C throughout before eating. Hands should be washed with soap and water after handling meat. Raw meat should never be fed to cats; only dry or canned food or cooked meat should be fed. Cats should be kept indoors and litter boxes changed daily. Cat feces should be flushed down the toilet or burned. Litter pans should be cleaned by immersing them in boiling water. Gloves should be used while working in the garden. Children's sandboxes should be covered when not in use.

REFERENCES

Dubey JP, Beattie CP: Toxoplasmosis of Animals and Man. CRC Press, Boca Raton, FL, 1988

Gazzinelli RT, Denkers EY, Sher A.: Host resistance to Toxoplasma gondii: model for studying the selective induction of cell-mediated immunity by intracellular parasites. Infect Agent Dis 2:139, 1993

Georgie VA: Management of toxoplasmosis. Drugs, 48:179, 1994

Guerina NG, Hsu HW, Meissner HC, Meissner HC, et al. Neonatal serologic screening and early treatment for congenital Toxoplasma gondii infection. N Eng J Med, 330:1858, 1994

Remington, JS, McLeond R, Desmonts G.: Toxoplasmosis. In: Remington JS, Klein JO, (eds.): Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1995

Injections

بررسی اثر اپیوم موضعی در درمان سالك

دكتر محمدعلی ماپار ، دكتر حسین كاوسی ، دكتر محمد علی دباغ

1-استادیار گروه پوست، 2- دستیار گروه پوست، 3- استادیار گروه داروسازی؛ دانشگاه علوم پزشكی اهواز

  مقدمه

سالك بیماری شایع پوستی است  كه در بسیاری از نقاط دنیا مشاهده می‌گردد. كشور ایران از جمله مناطقی است كه این بیماری به صورت بومی در آن وجود دارد(1). خوزستان از كانونهای مهم سالك در ایران است(2). عامل بیماری سالك در كشور ما معمولاً لیشمانیا تروپیكا و لیشمانیا ماژور  و ناقلین آن فلبوتوموس پاپاتاسی، فلبوتوموس سرژانتی و فلبوتوموس انصاری می‌باشد(1).

سالك با نماهای بالینی مختلف تظاهر می‌نماید. ضایعة معمولاً به صورت پاپول قرمز رنگی شروع می‌گرددكه به تدریج بزرگتر می‌شود و در نهایت به صورت پلاك زخمی درمی‌آید و در طی حدود یك سال با برجای گذاشتن جوشگاه بدنما بهبود می‌یابد(3).

سالك یك بیماری خود محدود شونده است ومعمولاً درطی یك سال بهبود می‌یابد. آنچه كه درمان سالك را ضروری می‌سازد این است كه در 10% موارد، بیماری سالك به صورت مزمن یا لوپوئید درمی‌آید(3). وجود ضایعه درنواحی غیرپوشیده بدن منجر به جوشگاه بدنما می‌گردد. در كانونهای شهری، انسان ممكنست مخزن بیماری باشد و با درمان مناسب موارد انسانی، از احتمال انتقال عفونت به افراد سالم كاسته می‌شود(3). تاكنون روش‌های مختلفی برای درمان بیماری سالك به كار رفته و در مطالعات متعدد، نتایج متفاوتی از اثرات این داروها گزارش گردیده است.

اپیوم خام یا تریاك  معمولاً به عنوان ضد درد كاربرد دارد. این ماده دارای اثرات دیگری در درمان سرفه، اسهال ساده و در گذشته در بیماری دیابت بوده است(4). كپسول خشخاش به صورت موضعی جهت تسكین درد و التهاب ساده و همچنین به صورت بخور در لارنژیت مصرف گردیده است(4).

در مطالعه‌ای بر روی موشهای آزمایشگاهی Balb/c كه به صورت تجربی با لیشمانیاماژور آلوده و زخم سالكی در آنها ایجاد گردیده بود، از اپیوم موضعی روزانه یك مرتبه به مدت دو هفته استفاده گردید كه در پایان دورة درمان 5/87% موشها از نظر بالینی بهبود یافته و 7/68% هم از نظر بالینی بهبودی نشان داده و هم ضایعات از نظر وجود جسم لیشمن در آزمایش مستقیم منفی شده بودند. روند بهبودی موشهای درمان شده به مدت 6 ماه پیگیری گردید و در این مدت هیچ گونه زخمی در ناحیة درمان یافته و سایر نقاط بدن حیوان مشاهده نگردید(5).

در بعضی مناطق روستایی ایران كه از نظر سالك اندمیك می‌باشد از تریاك بصورت موضعی در درمان سالك استفاده می‌گردد. این افراد ادعا نموده‌اند كه در طی مدت كوتاهی بطور كامل بهبود یافته‌اند. با توجه به استقبال بیماران از داروهای موضعی، هزینه پایین و اثربخشی دارو در مدلهای حیوانی، تلاش شد كه اثرات اپیوم موضعی در درمان سالك در انسان در یك مطالعه كارآزمایی بالینی
 دوسوكور مورد بررسی قرار گیرد.

روش اجرا

این مطالعه به صورت دوسوكور در مركز پیشگیری و مبارزه با بیماریهای واگیر در شهرستان اهواز انجام گرفت. مدت مطالعه دو سال و در سالهای 79-1378 بود. بیمارانی كه در این مطالعه قرار گرفتند دارای معیارهایی شامل: سن بالای دو سال، تعداد ضایعات كمتراز 6 عدد، دورة بیماری كمتر از 3 ماه، عدم مصرف داروی مؤثر بر سالك قبل از مراجعه و مثبت بودن آزمایش مستقیم(اسمیر) از نظر وجود جسم لیشمن بودند. زنان مبتلا به سالك كه شیرده یا حامله بودند وارد مطالعه نشدند.

بیماران پس از دادن آگاهی مختصر در مورد سالك و نوع درمان مورد نظر و كسب موافقت بیماران یا والدین آنهاتحت مطالعه قرار می‌گرفتند. از 96 بیمار واجد شرایط كه در مطالعه قرار گرفتند 58 بیمار دورة درمان را به پایان رساندند و 38 بیمار به دلایل مختلف از مطالعه خارج شدند.

بیماران در دو گروه دریافت كننده دارو یا دارونما بر اساس ظرف دارویی كه از قبل كدگذاری گردیده بود تقسیم گردیدند. در روزهای زوج ظرف دارویی با كدA و در روزهای فرد ظرف دارویی با كد B  به بیماران داده شد.

موارد بكار رفته در تهیه دارو شامل تركیبات زیر بود: تریاك یا اپیوم خام تهیه شده از ستاد مبارزه با موادمخدر طی نامه شماره 1875 مورخ 15/1/78، اوسرین، وازلین، پروپیلن گلیكول، اتانول 96 درجه، متیل پارابن، پروپیلن پارابن، محلول سود 5%

تریاك حاوی آلكالوئیدها و مواد دیگری است كه بخشی از آن محلول در آب و بخشی محلول در الكل است. در ابتدا تریاك در الكل حل گردید. سپس مقدار بسیار مختصری سود 5% اضافه گردید و از صافی عبور داده شد. بدین ترتیب عصارة الكلی تریاك تهیه گردید. سپس مواد باقیمانده در آب حل گردید و مجدداً مختصری سود اضافه گردید و از صافی عبور داده شد و عصارة‌ محلول در آب تریاك جدا گردید. كاربرد سود باعث تسهیل در جداسازی الكالوئیدهای تریاك می‌گردد. بدین ترتیب عصارة الكلی، عصارة محلول در آب و مواد باقیمانده بدست آمد. اوسرین و وازلین در 120 درجه سانتی گراد به مدت یك ساعت حرارت داده شد. سپس عصارة محلول در آب با اوسرین و عصاره الكلی و مواد باقیمانده با وازلین مخلوط گردید. از پروپیلن گلیكول بعنوان عامل افزایش دهنده نفوذ و جاذب رطوبت،‌متیل پارابن و پروپیل پارابن بعنوان محافظ استفاده گردید.

بدین ترتیب تركیبات دارویی زیر تهیه شد:

1-عصارة الكلی تریاك در وازلین 10%؛

2-عصارة محلول در آب تریاك در اوسرین 10%؛

3-مواد باقیمانده در وازلین 10%.

برای تهیه دارونما، از مواد ذكر شده  بدون تریاك استفاده گردید و برای ایجاد رنگ مشابه، Cochineal red  بعنوان ماده رنگی به كار رفت.

تمامی مراحل تولید دارو تحت شرایط آسپتیك انجام گرفت و فرآورده‌ها در تیوب‌های مخصوصی كه از قبل حرارت داده شده بود جای داده شدند و روی تیوب‌ها، كدهای مخصوصی نوشته شد. تمامی مراحل تولید و كدگذاری دارو در آزمایشگاه دانشكده داروسازی تحت نظر متخصص داروساز صنعتی بوده است.

مشخصات بیماران تحت مطالعه در پرسشنامة مخصوصی یادداشت و نتیجه معاینات بالینی ثبت و از بیماران یا والدین رضایت‌نامه كتبی اخذ می‌گردید. به هر بیمار یك ظرف دارو كه كد مخصوصی داشت تحویل می‌گردید و در پرسشنامه كد دارو نوشته می‌شد. به بیماران توصیه گردید كه قبل از استفاده از دارو، ضایعه را با آب  معمولی شسته و خشك نمایند و بعد از استعمال دارو، روی آن را با گاز استریل بپوشانند. دارو دوبار در روز و به مدت دو هفته استعمال می‌گردید. بیماران جهت پیگیری هفتگی مراجعه می‌كردند . تأكید گردید در صورت بروز مشكل، سریعاً به پزشك مربوطه مراجعه نمایند.

در پایان هفته دوم، نتیجه معاینات بالینی و عوارض مشاهده شده ثبت می‌گردید. در بیمارانیكه پاسخ خوبی به درمان داده بودند در پایان هفته دوم مجدداً آزمایش مستقیم از ضایعه بعمل می‌آمد و در صورت منفی بودن آزمایش، به بیمار توصیه می‌گردیدكه هر دو هفته یكبار مراجعه و ضایعه مورد ارزیابی قرار گیرد. در پایان هفته هشتم، مجدداً‌ از ضایعه آزمایش مستقیم به عمل می‌آمد و در صورت منفی بودن آزمایش و بهبود بالینی ضایعات، بیمار به عنوان درمان شده در نظر گرفته می‌شد.

به طور كلی معیارهای ارزیابی بیماران عبارت بودند از:

1-بهبودی كامل یا درمان شده: كاهش قابل توجه در اندازه، سفتی و التهاب ضایعه به همراه آزمایش مستقیم منفی ا زضایعه.

2-بهبود نسبی: كاهش قابل توجه در اندازه، سفتی و التهاب ضایعه  ولی آزمایش مستقیم مثبت یا كاهش نسبی در اندازه، سفتی و التهاب ضایعه با آزمایش مستقیم منفی.

3-عدم پاسخ: عدم بهبودی ضایعه.

بیمارانی كه پاسخ نسبی یا عدم پاسخ به درمان دادند روی درمان دیگری قرار می‌گرفتند. در پایان مطالعه كدهای ثبت شده در پرونده با نوع داروی مصرفی تطبیق داده شد. اطلاعات ثبت شده در پرونده بیماران جمع آوری گردید و نتایج به دست آمده مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گرفت. در پایان مطالعه نوع داروی مصرفی با توجه به كدهای ثبت شده در پرونده مشخص گردید و اطلاعات موجود در پرونده‌ها جمع‌آوری گردید و نتایج به دست آمده مورد تجزیه و تحلیل با آزمون آماری chi-square قرار گرفت.

یافته‌ها

در این مطالعه 96 بیمار (58 مرد و 38 زن) تحت درمان قرار گرفتند كه از این تعداد 52 بیمار دارو و 44 بیمار دارونما دریافت نمودند. در گروه دریافت‌كنندة دارو از 52 بیمار، 34 بیمار و از گروه دریافت كننده دارونما از 44 بیمار، 24 بیمار دورة درمان را به پایان رساندند و در مطالعه قرار گرفتند. بدین ترتیب 58 بیمار (37مرد و 21 زن) تحت درمان قرار گرفتند و دوره درمان را به پایان رساندند و 38 بیمار (21 مرد و 17 زن) از مطالعه خارج شدند.

گروه دریافت كننده دارو شامل 34 بیمار (21 مرد و 13 زن) بوده كه سن متوسط آنها 2/18 سال و تعداد ضایعات بطور متوسط 2 عدد و شایعترین شكل بالینی ضایعات بصورت پلاك زخمی بود. شایعترین محل ضایعه اندام فوقانی و طول متوسط شروع بیماری 2/2 ماه بود. هیچكدام از بیمارانیكه دارو را استعمال كردند عارضه جانبی خاصی را ذكر نكردند. در این گروه، 5 بیمار (7/14%) پاسخ كامل، 3 بیمار (9/8%) پاسخ نسبی و 26 بیمار(4/76%) به درمان پاسخ ندادند.

گروه دریافت كننده دارونما شامل 24 بیمار (16 مرد و 8زن) بوده كه سن متوسط آنها 4/21 سال بود. تعداد ضایعات بطور متوسط 6/2 عدد و شایعترین شكل بالینی ضایعات بصورت پلاك زخمی بود. شایعترین محل ضایعه اندام تحتانی و طول متوسط شروع بیماری1/2‌ ماه بود. در این گروه، 1 بیمار (2/4%) پاسخ كامل، 2 بیمار(3/8%) پاسخ نسبی و 21 بیمار (5/87%) به درمان پاسخ ندادند.

با استفاده از تست آماری chi-square ، از نظر آماری اختلاف معنی‌داری درپاسخ به درمان بین دو گروه وجود نداشت(12/0=P).

 بحث

تاكنون اقدامات درمانی مختلفی در درمان سالك بكار رفته است كه بطوركلی شامل درمان فیزیكی یا جراحی و درمان دارویی می‌باشد. درمان فیزیكی و جراحی شامل كرایوتراپی، گرمای موضعی، كورتاژ و لیزرآرگون می‌باشد(9-6). درمان دارویی شامل درمان سیستمیك و موضعی است. مهمترین داروهای سیستمیك عبارتند از : آنتی موانهای پنج ظرفیتی  (گلوكانتیم و پنتوستام)، كلروكین، پنتامیدین، مترونیدازول، كتوكونازول، داپسون، ایتراكونازول، تربینافین و ریفامپیسین(10).

داروهای موضعی به كار رفته شامل: كیناكرین، مایكونازول، كلوتریمازول، گلوكانتیم، كلروپرومازین، پارامومایسین، آمفوتریسین، كرم سیر و دارویZH-E می‌باشند(13-10و 3 و 1).

تریاك یا اپیوم خام از شیره گیاه خشخاش با نام علمی Papavera Somniferum استحصال می‌‌گردد. تریاك حاوی 30 آلكالوئید (14) و مواد دیگری نظیر اسید مكونیك، مكونین، پورفیروزین، موسیلاژ، پكتین، مواد آلبومینوئید ، موم، كائوچو، رزین، املاح معدنی و مواد قندی است(4). مهمترین آلكالوئیدهای تریاك شامل مورفین، كدئین، تبائین، نوسكاپین، نارسیئن و پاپاورین هستند(14). مكانیزم اثر اپیوم از طریق گیرنده‌های آنها در مغز، طناب نخاعی و جاهای دیگر است. گیرنده‌های اپیوم مو (μ ) ، كاپا (κ ) و دلتا(δ ) می‌باشند كه همگی آنها درك درد را كاهش می‌دهند(15).

اپیوئیدها روی‌سیستم‌ایمنی‌اثرات مختلفی‌دارند.آنها قادر به رهایی هیستامین از ماست سل‌ها هستند و منجر به خارش وواكنشهای‌آلرژیك می‌شوند. همچنین روی لكوسیتها اثر داشته وممكنست سبب تغییراتی در سیستم ایمنی شوند(15). لنفوسیتها و ماكروفاژها دارای گیرنده‌هایی هستند كه قادر به پاسخگویی به اندورفین‌ها و انكفالین‌ها (اپیوئیدهای اندوژن) می‌باشند. بعلاوه قادر به تولید مواد شبه اندورفین هستند كه عمل لنفوسیتها را تنظیم می‌نمایند(16).

اپیوم در طب سنتی، در موارد مختلفی استفاده می‌گردد. مهمترین كاربرد آن بعنوان ضد درد قوی است. موارد استفاده دیگر اپیوم در درمان اسهال ساده، سرفه، دیابت(درگذشته)، بیخوابی، دردها و هیجانات عصبی، صرع و حالات اضطرابی می‌باشد. ولی همیشه بایستی در نظر داشت كه استفاده اپیوم موجب وابستگی می‌گردد(4).

در بررسی اپیوم خام در شرایط آزمایشگاهی بر روی شكل تاژك دار انگل (پروماستیگوت) مشاهده گردید كه حداقل غلظت مهاری تحریك و رشد 50% انگل به ترتیب 1/1 و 45/0 میلیگرم در میلی لیتر و حداقل غلظت مهاری تحریك و رشد 100% انگل به ترتیب 4 و 2 میلی گرم در میلی لیتر بود. در بررسی اپیوم خام بر روی موشهای Balb/c كه بصورت تجربی آلوده به لیشمانیا گردیدند، بعد از دو هفته درمان با اپیوم موضعی 5/87% بهبود بالینی و 7/68% بهبود بالینی و آزمایشگاهی گزارش گردید(5).

در این مطالعه كه با استفاده از اپیوم موضعی به مدت دو هفته در درمان سالك انجام گرفت مشاهده گردید كه اختلاف معنی داری در پاسخ به درمان، بین گروه گیرنده دارو و دارونما وجود ندارد (12/0 = P). علت عدم تأثیر دارو می‌تواند دورة كوتاه درمان، ضعیف بودن غلظت تریاك در پماد، عدم نفوذ كافی دارو در ضایعه و یا حجم كم نمونه‌های مورد مطالعه باشد. همچنین این احتمال وجود دارد كه سالك در موش سیر بالینی متفاوتی باانسان داشته باشد. همچنین احتمال سوگرایی(Bias) در مطالعه قبلی تأثیر اپیوم موضعی در لیشمانیوزیس موش وجود دارد. بنابراین ما پیشنهاد می‌كنیم كه بررسی دارو با غلظت و تركیبات متفاوت، ابتدا در حیوانات آزمایشگاهی انجام گیرد و در صورت مثبت بودن نتایج، مجدداً مطالعه روی موارد انسانی انجام پذیرد.

منابع

 1-Dowlati Y. Cutaneous leishmaniasis: Clinical aspect. Clin Dermatol 1997; 14: 425-31.

2-اردهالی ص، رضایی ح، ندیم ا. انگل لیشمانیاو لیشمانیوزها. تهران: مركز نشر دانشگاهی، 1363: 161.

3- اصیلیان ع. لیشمانیوز جلدی (سالك). اصفهان: انتشارات دانشگاه علوم پزشكی اصفهان 1371 :40-38 و 55-54.

4-زرگری ع. گیاهان دارویی. تهران: انتشارات دانشگاه تهران، 1368: 130-128.

5-جلالی ع، مراغی ش، كوچك م. بررسی اثر اپیوم موضعی (شیره گیاه Papavera Somniferum ) بر روی لیشمانیا. پایان نامه جهت دریافت درجه دكترای داروسازی،دانشگاه علوم پزشكی اهواز، 1375: 56-52.

6-Al Gindan H, Kubba R. Cryosurgery in old
world cutaneous leishmaniasis. Br J Dermatol 1998; 118: 851-54.

7-Junid AJ. Treatment of cutaneous leishmaniasis with infrared heat. Int J Dermatol 1986; 25: 470-72.

8-Currine MA. Treatment of cutaneous leishmaniasis by currettage. Br Med J 1983; 287: 1105-6.

9-Rakcheev AP, Chistiakova IA. The succesful treatment of cutaneous leishmaniasis with an argon laser. Veston Dermatol Venerol 1989; 12: 53-55.

10-Lerner EA, Grevelink SA. Leishmaniasis. In: Arndt K A, LeBoil P E, Robinson JK, et al (eds). Cutaneous medicine and surgery. Philadelphia:W.B.Saunders, 1996:1163-70.

11-Vardy D, Baranholz Y C. Topical amphotericin B for cutaneous leishmaniasis. Arch Dermatol 1997; 135: 856-57.

12-غلامی ع، خامسی پور ع، مؤمنی ع و همكاران. اثر كرم حاوی سیر 5% در درمان سالك. فصلنامه بیماریهای پوست، 1379 : 3 :‌6-2.

13-Zerehsaz F, Salmanpour R, Handjani F. A double-blind randomized clinical trial of a topical herbal extract (ZHE) vs systemic meglumine antimonate for treatment of
cutaneous leishmaniasis in Iran. Int J Dermatol 1999; 38: 610-12.

14-Ewans WC. Trease and Evans pharmacognosy. Philadelphia: W.B. Saunders, 1996: 368-69.

15-Robert M, Julien M D. A Prime of drug action. New York: WH Freeman and Company, 1997: 285-90.

16-Terr AI, Dubey DD, Yunis EJ. Physiologic and enviromental influences on the  immune system. In: Stites D P, Terr A I (eds). Basic and clinical immunology. Prantice Hall International Inc,1991:187-85.

مجلات نمايه‌شده در ISI

عناوين مجلات نمايه شده در بانك اطلاعاتي ISI Web of Science

بانك اطلاعاتي ISI Web of Science‌ از 3 مجموعه زير تشكيل شده است:

1- مجموعه بانك Science Citation Index Expanded با عنوان اختصاري SCI-EXPANDED
2- مجموعه بانك Social Sciences Citation Index با عنوان اختصاري SSCI
3- مجموعه بانك Arts & Humanities Citation Index با عنوان اختصاري A&HCI

براي بررسي وجود يك عنوان مجله خاص در اين بانك و يا براي دستيابي به فهرست مجلات نمايه شده در اين بانك كافي است روي نام بانك مربوطه كليك كرده و در صفحه مربوطه گزينه مناسب را انتخاب كنيد.

لازم به‌ذكر است كه با توجه به موضوع، اكثر نشريات رشته‌هاي علوم پزشكي در لينك اول بايستي جستجو شوند.

مطالب ذیل را با اجازه دوستان عزیز از سایت بسیار کاربردی آزمایشگاهی ذیل برایتان قرار می دهم :http://azkadeh.com

در باره :مالاريا (About Malaria)
تعريف بيماري:
مالارياي انساني كه به نامهاي پالوديسم(Paludism) ، تب حارَه اي، تب نوبه، تب و لرز، تب متناوب و تب جنگل هم ناميده مي شود، يك بيماري عفوني خوني است كه توسط تك ياخته اي از جنس پلاسموديوم (Plasmodium) ايجاد و توسط پشه هاي جنس آنوفل(Anopheles) منتقل مي گردد.
علائم مالاريا (Paroxysm) :
علامت متداول بيماري تب شديدي است كه همراه با ساير علائم مربوطه (لرز ، عرق) براي مدت 5 تا 8 ساعت ادامه يافته و سپس هر 2 يا 3 روز يكبار باز مي گردد. هر يك از اين حملات، نيروي بيمار را به شدت تحليل برده و باعث كاهش شديد فعاليت هاي بيمار در طي دوران بيماري مي گردد.


علائم مالاريا (Paroxysm) :

علامت متداول بيماري تب شديدي است كه همراه با ساير علائم مربوطه (لرز ، عرق) براي مدت 5 تا 8 ساعت ادامه يافته و سپس هر 2 يا 3 روز يكبار باز مي گردد. هر يك از اين حملات، نيروي بيمار را به شدت تحليل برده و باعث كاهش شديد فعاليت هاي بيمار در طي دوران بيماري مي گردد. حملات اوليه مالارياي حاد حداقل 2 هفته يا بيشتر طول مي كشد و در اثر ابتلاهاي مكرر و همراه با پيشرفت بيماري ، كم خوني و بزرگي طحال حادث شده كه در اكثر بيماران در طي يك يا دو هفته بعد از حمله اوليه مي توان آنرا لمس نمود. در صورتيكه عامل ابتلا انگل گونه فالسيپارم باشد مي تواند منجر به گلومرولونفريت ، افزايش شديد پارازيتمي، پديده جداسازي مويرگي (Sequestration)، گيجي ، تشنج ، كاهش فشارخون ، ادم ريوي، علائم گوارشي (مثل استفراغ ، دردهاي شكمي ، اسهال ، خونريزي روده اي) ، سندرم نفروتيك، كولاپس گردش خون، سيانوز و مرگ شود.

دوره نهفتگي بيماري(Incubation Period) بطور معمول از 9 تا 30 روز متفاوت است و ممكن است تا چندين ماه طول بكشد. گونه هاي پلاسموديوم ويواكس در مناطق معين جغرافيايي دوره نهفته طولاني و بيشتر از 10 ماه دارند.

1 يا 2 روز قبل از شروع علائم تعداد كمي انگل در گردش خون ظاهر مي شوند سپس با افزايش تعداد انگلها ، علائم مختلف شروع به تظاهر مي كنند كه عبارتند از سردرد ، خستگي ، دردهاي مبهم در عضلات و استخوانها و مفاصل ، احساس لرز و تب كه بدليل شبيه بودن علائم با بيماريهاي ويروسي مثل سرماخوردگي و آنفلوانزا(Influenza) بخصوص در مناطق غير آندميك تشخيص را بر مبناي اين بيماريها مي گذارند. در طي چند روز آينده وقتي كه تعداد انگلها در خون به حد كافي رسيد علائم مالاريا بروز مي نمايد

علايم متداول مالاريا در بين مراجعين به Virtual Naval Hospital در آمريكا





ابتدا الگو هاي تب بصورت منظم نيست ولي بعدا در صورتي كه دوره هاي شيزوگوني همزمان شود رفته رفته اين الگو ها حالت منظمي را به خود مي گيرد كه به آنSynchronized مي گويند. بطور كلي يك حملة مالاريا شامل مراحل زير است:

1- مرحله سرما (Cold Stage ) : ناگهاني شروع مي شود. بيمار شديداً احساس كسالت نموده، دچار سردرد و دردهاي استخواني شده و تمام بدن با سرماي شديد و غير قابل تحملي به مدت 1 ساعت شروع به لرز مي نمايد.

2- مرحله گرما ( Hot Stage ) : با بالا رفتن دماي بدن به حدود 40 تا 41 درجه سانتيگراد لرز متوقف شده و تب شديدي بدن را فرا مي گيرد كه مدت 1 تا 2 ساعت اين وضعيت ادامه دارد . دورة تب بر حسب گونه هاي مختلف پلاسموديوم متفاوت و به صورت زير مي باشد.

- تب 3 به 1 : حملات تب يك روز درميان روي مي دهد. عامل آن پلاسموديوم اووال ، ويواكس و فالسيپارم ميباشد.

- تب 4 به 1 : حملات تب دو روز درميان و توسط پلاسموديوم مالاريه ايجاد مي گردد.

3- مرحله تعريق ( Sweating Stage ) : پس از گذشت 1 تا 2 ساعت از شروع تب ، بيمار شروع به عرق نمودن كرده كه در پايان اين مرحله و با گذشت 5 الي 8 ساعت از شروع تب ، درجه حرارت بدن به حد طبيعي باز مي گردد، بيمار خسته اما بدون علامت است و تا شروع مرحلة بعدي احساس آرامش مي كند.

روشهاي انتقال مالاريا :

شيوع و انتقال هر نوع مالاريا چه در مناطق اندميك و چه به صورت اپيدميك به عوامل بيشماري مثل نوع و سوش انگل ، ميزان ايمني انسانها ، عادات زيستي پشه ها ، عادات زيستي انسانها ، شرايط محيطي از قبيل درجه حرارت، رطوبت، ميزان بارندگي، نوع گياهان منطقه نوع و روشهاي مبارزه و . . . بستگي دارد كه اين عوامل را ميتوان در ارتباط با سه عامل شخص سالم و آلوده بعنوان گيرنده و دهندة بيماري ، انگل پلاسموديوم بعنوان عامل ايجاد كنندة بيماري و پشه آنوفل بعنوان انتقال دهندة بيماري طبقه بندي نمود. بطور كلي انتقال مالاريا از طرق زير مي تواند صورت بگيرد:

· انتقال طبيعي : انتقال از طريق نيش پشه آنوفل

· انتقال اكتسبي : انتقال از طريق تلقيح

انتقال طبيعي مالاريا (انتقال از طريق نيش پشه آنوفل):

عمده ترين راه انتقال بيماري مالاريا انتقال از طريق نيش پشه آنوفل ماده مي باشد كه در سال 1897 توسط رونالد راس ثابت شد. اين پشه ها در اكثر كشورهاي مناطق معتدله و حاره و هر جا كه محل زيست مناسبي براي آنها فراهم شود وجود دارند.

نحوة انتقال به اين صورت مي باشد كـه پشه هاي ماده در طي خونخواري از شخص آلــوده، انگل را بلعيده و انگل در بدن پشه پس از طي دوره و زمان خاصي مجدداَ به فرم آلوده كننده درآمده و همراه با محتويـات بزاق طــي خونخواري بعدي بـه افراد سالم جامعه منتقـل مي گـردد و اين چرخه تا جايي كه توسط عامل بخصوصي قطع نگردد ادامـه پيدا ميكند.

در اين چرخه براي آلوده شدن پشه ها، علاوه بر وجود ناقل مناسب وجود انسان مخزن ( (Human reservoir داراي مقدار لازم گامتوسيت در خون وي ضروري مي باشد. بنابراين انسانهايي كه به تازگي آلوده شده اند نمي توانند بيماري مالاريا را انتقال دهند.

انتقال اكتسابي ( انتقال از طريق تلقيح ):

در صورتيكه مالاريا غير از انتقال توسط نيش پشه آنوفل از طُرق ديگر منتقل شود به اين نوع مالاريا، مالارياي تلقيحي مي گويند. در سال 1884 انتقال مالاريا از طريق انتقال خون توسطGerhardet ثابت گرديد. در سال 1911 اولين مورد مالارياي ناشي از انتقال خون در آمريكا بوسيله Woolsey مشاهده شد.

در مناطقي كه انتقال مالاريا بوسيله پشه آنوفل انجام مي گيرد اهميت انتقال مالاريا از ساير راهها تحت الشعاع موارد انتقال عادي آن قرار ميگيرد، ولي در مناطقي كه انتقال طبيعي مالاريا بوسيله پشه آنوفل قطع شده است ولي حاملان انگل وجود دارند در صورتيكه عامل مالاريا پلاسموديوم فالسيپارم باشد و بموقع تشخيص داده و درمان نگردند، مي تواند به مرگ بيمار منجر شود.

مكانيزم عمل اين نوع انتقال به اين صورت است كه در افراد مبتلا به مالاريا در صورتيكه درمان كامل يا اساسي انجام نگرفته باشد پس از توسعه مصونيت نسبي (Premunition) ، تعداد انگل در خون به حداقل رسيده و مانع بروز علائم باليني مي شود و گاهي تعداد انگل در خون به حدي كم است كه در آزمايش ميكروسكپي معمولي نمونه خون نمي توان آنها را ديد ولي اگر خون اين افراد حامل انگل به افراد سالم از نظر بيماري تلقيح گردد، انگلهاي مرحله شيزوگوني خوني موجود در گلبول قرمز شروع به تكثير كرده و در گيرنده خون علائم مالاريا ظاهر مي گردد .

انواع پلاسموديوم هاي انساني در مالارياي ناشي از انتقال خون به ترتيب پلاسموديوم ويواكس، پلاسموديوم مالاريه ، پلاسموديوم فالسيپارم و پلاسموديوم اووال بوده اند كه در سالهاي اخير جاي خود را به پلاسموديوم مالاريه داده است، بنابراين در مالارياي ناشي از انتقال خون پلاسموديوم مالاريه نقش اصلي را دارد. مالارياي تلقيحي موارد زير را شامل مي گردد :

1. انتقال از طريق انتقال خون

2. انتقال از طريق پيوند اعضاء

3. انتقال از طريق مالاريا تراپي

4. انتقال از طريق هموتراپي

5. انتقال از طريق مادر به جنين

6. انتقال از طريق سرنگ آلوده

7. انتقال بصورت تصادفي ( آلودگي شغلي )

-----------------------------------------------------------------

تاريخچه مالاريا ( Malaria History )

مالاريا احتمالاَ بيماري قبل از پيدايش انسان است. منشاء احتمالي مالاريا بايد قاره آفريقا باشد و با مهاجرت انسان در طي دوران نوسنگي به اروپا و آسيا ( خاورميانه ، هند ، چين ) انتشار يافته است. انتشار اين بيماري به آمريكاي مركزي و جنوبي احتمالاَ از آسيا در هزارة اول ميلادي بوده است. نحوة ورود مالاريا به جزاير كارائيب هنوز نامشخص بوده و حدس بر اين است كه يا از طريق آمريكا بوده يا از طريق برده ها به آنجا برده شده است.

مالاريا يكي از قديمي ترين بيماري شناخته شده انساني بوده، يك نشانگان دوره اي كه با تب و لرز همراه مي باشد و احتمالاً توصيف مالاريا مي باشد در ادبيات قديمي چين ، سال 700 ق. م.، و در ورقهاي پاپيروس، سال 1570 ق. م.، شرح داده شده است. همچنين مالاريا در نوشته هاي قديمي به زبان سانسكريت، قرن 5 ق. م. در آسيا و چين شرح داده شده است.

بقراط(Hippocrates) پزشك يوناني در قرن پنجم قبل از ميلاد به رابطه تب هاي متناوب با مرداب ها اشاره نموده و علائم مالاريا نظير بزرگي طحال را شرح داده است. تب ها بوسيله سقراط(Socrates) فيلسوف يوناني، قرن 4 ق. م.، به انواع مداوم، روزانه، سه گانه و چهارگانه تقسيم شدند و عامل سه نوع آخر مالاريا دانسته شد. در بررسيهاي تاريخي علت شكست ارتش آتن در محاصره بندر سيسيليان سيراكوس، سال 413 ق. م.، و علت مرگ اسكندر مقدوني(Alexandre) در سن 32 سالگي، سال 323 ق. م.، را بيماري مالاريا مي دانند.

نام مالاريا از دو لغت ايتاليايي " Malo " به معني بد و "Aria " به معني هوا گرفته شده است. به دليل اينكه رم (Rome) در زمانهاي قديم شهري بوده كه توسط زمينهاي باتلاقي احاطه مي شده است و انتقال مالاريا در اطراف اين شهر را كه به سبب ايجاد محل مناسب براي رشد پشه ها فراهم شده بود ناشي از هواي فاسد بر روي آب راكد مي دانستند، لغت مالاريا به معني آب و هواي بد به اين بيماري اطلاق شد.

بدنبال تحقيقاتي كه در زمينه شناخت مالاريا در طي ساليان متمادي انجام شد سرانجام در سال 1880، پلاسموديوم مالاريه بوسيله لاوران (Laveran) شرح داده شد. در سال 1890 پلاسموديوم ويواكس توسط گراسي و فلتي (Grassi & Feletti) نامگذاري شد. در سال 1897 پلاسموديوم فالسيپارم توسط ولچ (Welch) و در سال 1922 پلاسموديوم اووال توسط استفنس (Stephens) توصيف شدند.

رونالد راس(Ronald Ross) بدنبال تحقيقاتي كه به پيشنهاد سرپاتريك مانسون در سكندرآباد و كلكته هندوستان انجام داد توانست در سال 1897 اسپوروگوني يك گونه پلاسموديوم بنام پلاسموديوم رليكتوم (Plasmodium Relictum) كه در پرندگان وجود داشت را در پشه كولكس كشف و گزارش دهد و به اين طريق توانست انتقال مالاريا توسط پشه ها را اثبات كند. اثباتي كه منجر به دريافت جايزه نوبل در سال 1902 گرديد ، گرچه ايدة انتقال مالاريا توسط پشه ها قبلاَ توسط ديگران بخصوص توسط پزشك رومي ، لانسيني، در سال 1717 و آلبرت كينگ در سال 1882 پيشنهاد شده بود.

در همان زمان گراسي (Grassi) و همكاران چرخه جنسي مشابهي را در پلاسموديوم فالسيپارم و در پشه آنوفل گزارش دادند و پشه آنوفل را بعنوان پشه ناقل شناسايي كردند. چرخه خارج اريتروسيتي (Exoerythrocytic cycle) مالاريا در انسان در سال 1948 بوسيله Shortt و همكاران شناسايي شد.

كلمه مالاريا طبق نوشته فرهنگ آكسفورد براي اولين بار در سال 1740 ميلادي توسط Horace Walpole به عنوان يك لغت انگليسي بكار برده شد و ظاهراَ در سال 1827 توسط John Callough عملاَ وارد فرهنگ زبان انگليسي گرديده است.

-----------------------------------------------------------

اهميت مالاريا

مالاريا يكي از علل عمدة همه گيري هاي بزرگ گذشته بوده است. اين همه گيري ها به شكل دوره اي به دنبال بارندگي هاي بيش از حد و سيل در نواحي خشك و يا در دشت هاي حاصلخيز رودخانه اي اتفاق افتاده و بدبختي حاصله از چنين بلاهايي را دو چندان كرده است.

همه گيري هاي مالاريا تلاش براي سكونت در نواحي جنگلي و آبياري زمينهاي خشك را خنثي نموده و جمعيت هاي بي خانمان و آوارگان را مصيبت زده نموده است. اين همه گيري ها به دنبال غارت و جنگ برخاسته و با توقف لشكر كشي ها گسترده شده ، و بازسازي هاي سريع زندگي روستايي و شهري را مختل نموده است.

گرچه امروزه ، در سايه تلاشهاي فراوان و زحمات بي دريغ كاركنان بهداشتي و در اثر توسعه نظام خدمات بهداشتي درماني ، بهبود كيفي و كمي مراقبت ها و امكانات تشخيصي و درماني و از همه مهمتر ارتقاء سطح آگاهيها و باورهاي بهداشتي مردم و رويكرد آنها به سوي رفتارهاي بهداشتي شاهد موفقيت هاي چشمگيري در زمينه كاهش موارد مالاريا در بسياري از كشورهای دنيا هستيم ، ولي وضعيت بيماري در برخي از كشورها ، سهولت و تكرر رفت و آمدها ، پنهان ماندن علائم ابتلا به عفونت در تعدادي از مبتلايان موجب شده است تا هميشه يك نگراني ضمني نسبت به خطر وقوع همه گيري مالاريا وجود داشته باشد. از آنجاييكه همه گيري هاي مالاريا علاوه بر ايجاد مشكلات بهداشتي، بيشتر توسعة اقتصادي را تحت تاثير قرار مي دهند می توان اهميت مالاريا از دو جنبه بهداشتي و اقتصادي بررسی نمود.

اهميت بهداشتي موضوع :

مالارياي انساني يك بيماري عفوني خوني است كه حدود 40 درصد جمعيت دنيا را تهديد مي كند. اين بيماري علاوه بر اينكه در طي حملات خود نيروي بيمار را به شدت تحليل برده و باعث كاهش شديد فعاليت هاي بيمار در طي دوران بيماري مي گردد ، موجب تضعيف بهداشت و رفاه عمومي در خانواده ها شده ، حيات كودكان را به مخاطره مي اندازد و باعث فرسودگي بيش از حد جامعه و منابع انساني كشورها مي شود.

در حال حاضر اين بيماري هنوز هم مهمترين مشكل بهداشتي دنيا است و حدود 107 كشور در دنيا بعنوان كشورهاي مالاريا خيز محسوب مي گردند. مرگ و مير ناشی از مالاريا بين 1/1 تا ۷/۲ ميليون نفر در سال گزارش شده است.

اهميت اقتصادي موضوع :

مالاريا با توجه به ميزان ابتلا و مرگ و مير در بين طبقات و گروههاي سني مختلف به خصوص طبقات فعال و توليد كنندة يك كشور مثل كارگران و كشاورزان تاثير سويي برروي توليدات و اقتصاد آن كشور بخصوص در جوامع كشاورزي دارد. آثار اقتصادي مالاريا به خصوص در نواحي روستايي قابل ملاحظه است چرا كه اغلب بروز مالاريا در زماني از سال است كه با فصل كشاورزي مصادف است. زيانهاي اقتصادي وارده توسط مالاريا بطور خلاصه عبارتند از :

- زيانهاي اقتصادي حاصله از مرگ و مير جميعت فعال

- زيانهاي اقتصادي ناشي از كم شدن قدرت كار و ميزان توليد در اثر ضعف و كم خوني

- زيانهاي مربوط به هزينه هاي درماني و مراقبت هاي پزشكي

- زيانهاي حاصله از كم شدن و از دست دادن وقت به علت غيبت از كار

- كاهش محصول كشاورزي و صنعتي در اثر كاهش و كمبود حضور كارگران مربوطه

- زيانهاي حاصله ناشي از توام بودن بيماريهاي ديگر با مالاريا و منجر شدن به مرگ شخص

- زيان اقتصادي ناشي از عدم انجام كشاورزي و كشت و كار در مناطق مالارياخيز كه معمولا با داشتن آب فراوان بهترين مناطق كشاورزي به شمار مي رود

--------------------------------------------------------

مالاريا در ايران

مالاريا از قديم به عنوان يكي از مسائل بهداشتي مهم تلقي شده و هيج بيماري ديگري به اين اندازه موجب زيان هاي مالي و جاني جبران ناپذير در كشور نشده است. همان طور كه مشخص است ، مهم ترين استان هاي دارای مشكل در كشور، عبارتند از سيستان و بلوچستان, هرمزگان , كرمان و فارس كه در مجموع 96 درصد از كل موارد را بخود اختصاص مي دهند.

سیمای کلی مالاریا در کشور طی پنج سال اخیر (1381-1386)

تعداد موارد مالاریا در طی سالهای 81-86 به غير از سال 82 که به طور غیر منتظره ای نسبت به سال 81 ، افزایش یافته است، سير نزولی يکنواختی را نشان می دهد.

از عمده دلایل افزایش موارد در سال 82 می توان به بارندگی بی سابقه در ماههای مرداد و شهریور سال مورد نظر و به دنبال آن ایجاد ژیت های لاروی گسترده در مناطق شرقی استان هرمزگان و جنوب سیستان و بلوچستان ، کاهش درجه حرارت و در نتیجه ازدياد وفور ناقل، افزایش شدید بیماری در مناطق مالاریا خیز کشورهای هم جوار ، عملیات نامناسب کنترل ناقلین به دلایل مختلف تدارکاتی از جمله فرسودگی تجهیزات سمپاشی و کمبود وسایل نقلیه عنوان کرد. با رفع نسبی نقائص و اقدامات مناسب پیشگیرانه در دانشگاه های علوم پزشکی مناطق جنوب شرقی کشور و هوشیاری سیستم بهداشتی در سال 83 وضعیت کنترل بیماری بهبود یافته و کاهش پنجاه درصدی موارد مالاریا حاصل گردید. در سال86 به دنبال سیل و طوفان گونو و علی رغم پیش بینی های کارشناسان مبنی بر افزایش چند برابری موارد مالاریا ، خوشبختانه بدلیل عملکرد صحیح و اقدامات به موقع کارکنان شاغل در امر کنترل مالاریای استانهای جنوب شرقی تعداد موارد مثبت نسبت به سال 85 تغییر معنی داری نداشت.

در طی سالهای 81 تا 86 همچون سالهای گذشته بیشترین میزان آلودگی به مالاریای ویواکس تعلق داشته که از سال 81 با یک روند صعودی روبرو بوده است. بدیهی است این روند صعودی به استثنای سال 82 نشان دهنده انتقال محلی در مناطق مالاریا خیز جنوب و جنوب شرقی کشور می باشد. کاهش موارد فالسیپارم نيز به شکلی موٌید افزایش انتقال محلی می باشد. می توان چنین قضاوت نمود که با کاهش تعداد مهاجران افغانی و پاکستانی درصد آلودگی به فالسیپارم در حال کاهش می باشد و به همان میزان موارد ویواکس جایگزین آن می شود.

طی شش سال اخیر چهره مالاریا از نظر توزيع بيماری به تفکيک مليت در کشور تغییر داشته است، به طوریکه در سال 81 بیش از نیمی از بیماران کشور را افراد غیر ایرانی تشکیل می دادند، در حالیکه در حال حاضر تنها 15% موارد بیماری به افراد غیر ایرانی تعلق دارد. در طی این سالها به تدریج با خروج افاغنه از کشور روز به روز بر نسبت مبتلایان ایرانی افزوده شده است.

چهره بیماری به غیر از گروه سنی 14-5 سال که روند افزایشی را نشان می دهد. درگروه های سنی زیر 4 سال و بالای 15 سال کاهش قابل توجهی را نشان می دهد. علت کاهش موارد ابتلای بالای 15 سال را می توان به دلیل کاهش ورود مهاجرین جویای کار از کشور های همجوار دانست. به دلیل آنکه اکثر مهاجرین به کشور در سن بالای 15 سال و نیروی کار محسوب می شوند، طبیعی است که با خروج آنان از کشور چهره بیماری تغییر یابد.

سیمای بیماری در استان هرمزگان از الگوی کشوری تبعیت نمیکند به گونه ای که درصد ابتلای گروه سنی زیر 4 سال به طور فزاینده ای از سال 81 تا 86 ازدیاد یافته و به همان نسبت درصد ابتلا در دو گروه سنی 14- 5 سال و بالای سال 15 نيزکاهش یافته است. می توان این­گونه تفسیر کرد که اکثر موارد بیماری در مناطق مشکل دار این استان به ويژه منطقه بشاگرد در حد فاصل شهرستان های جاسک و ميناب حاصل انتقال محلی مالاریا است.

حدود 12% از نسبت بیماران مرد در طی این سالها کاسته شده است، که با توجه به کاهش مهاجرین افاغنه از تعداد کاسته شدن از تعداد مبتلایان مرد طبیعی به نظر می رسد.

روند بیماری به لحاظ محل سکونت نيز طی سالهای مزبور تغییر یافته و بیشتر به سمت روستا معطوف گشته و بر این اساس بار دیگر می توان نتیجه گرفت که بیماری مالاریا در ایران بیشتر چهره محلی یافته است. از آن­جائیکه نیروی کار مهاجر بیشتر در شهرها و حاشیه آن متراکم هستند، در گذشته در شهرها موارد بیشتری از بيماری مشاهده می شد. از طرف دیگر بهبود وضعیت زندگی در شهرها و ارتقاء شاخص های رفاهی و نیز صنعتی شدن شهر ها، کمک قابل توجهی به جلوگیری از انتقال بیماری در مناطق شهری نموده است.

بررسی کاهش موارد وارده و انتقال از وارده در کنار افزایش انتقال محلی نشان می دهد که در حال حاضر موارد اتوکتنوئوس (Autochthonous) مالاریا (جمع موارد انتقال محلی و عود) در کشور در حال افزایش است و ضرورت برنامه ريزی بر مبنای طبقه بندی صحيح و شناسایی دقيق کانونها و اجرای عمليات کنترلی متناسب با طبقه بندی مناسب را بيش از پيش آشکار می نمايد.

رفرنس: برنامه حذف مالاریا درجمهوری اسلامی ایران (افق1400 )، وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی - معاونت سلامت

--------------------------------------------------------

مشخصات و مناطق انتشار آنوفلهاي مهم دنيا

1- An. aconitus

مناطق انتشار: شرق هندوستان، سريلانكا، مالزي، هندوچين ، اندونزي، جنوب چين

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي آفتابي، باتلاق ها، آبگيرها و نهرهاي داراي گياه، مزارع برنج، مجاري آبياري

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : اماكن داخلي و خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



2- An. albimanus

مناطق انتشار: آمريكا ( ايالت تگزاس و فلوريدا )، كلمبيا، اكوادور، ونزوئلا

نوع لانه لاروي: آب شيرين يا شور، مرداب هاي داراي گياه، لانه هاي لاروي آفتابي

محل خونخواري بالغ : اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري: داخل اماكن و ساختمانها

خونخواري از روي: انسان و حيوانات اهلي



3- An. albitarsis

مناطق انتشار: آمريكاي مركزي به طرف آمريكاي جنوبي، ترينيداد

نوع لانه لاروي: آبگيرها، باتلاق هاي بزرگ داراي جلبك، استخرهاي آفتابي

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري: در محيط خارجي

خونخواري از روي: انسان و حيوانات اهلي



4- An. aquasalis

مناطق انتشار: جزاير آنتيل، ترينيداد، توباكو، جزاير مجاور آمريكاي مركزي تا مناطق شمالي برزيل

نوع لانه لاروي : مرداب ها، باتلاق هاي آب شور و داراي جذر و مد ، خورها، رودخانه هاي آب شور

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : اغلب در محيط خارجي

خونخواري از روي : انسان و حيوانات اهلي



5- An. arabiensis

توضيحات: يكي از اسپس هاي آنوفل گامبيه، دومين ناقل مالاريا در دنيا

مناطق انتشار: اكثر كشورهاي آفريقايي بخصوص مناطق خشك صحرايي

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي موقت مثل آبگيرها، جاي پاي حيوانات، مزارع برنج، چاله ها آب

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : در داخل و خارج اماكن

خونخواري از روي: انسان، حيوان



6- An. azetecus :

مناطق انتشار : مكزيك ، در ارتفاعات بين 2200 - 1500 متر از سطح دريا

نوع لانه لاروي : آبگيرها، درياچه هاي داراي گياه، استخرها و حوض ها، كانال ها حتي با آب آلوده

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : در محيط خارج

خونخواري از روي : انسان



7- An. balabacensis

توضيحات: ناقل مالاريا در ، سوماترا و ساراواك، گونه جنگلي و وحشي

مناطق انتشار: هند، برمه، هندوچين، تايلند، مالزي، تايوان، سريلانكا، فيليپين، جاوه، برونئو، چين.

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي سايه دار، آبگيرها ي خاكي، جاي چرخ وسايل نقليه، جاي پاي حيوانات

محل خونخواري بالغ: اماكن خارجي

استراحت بعد از خونخواري : اماكن خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات



8- An. bellator

مناطق انتشار: ونزوئلا، سورينام ، برزيل ، گينه و ترينيداد

نوع لانه لاروي: آبهاي جمع شده در ميان برگهاي گياه Bromeliade ، لانه هاي لاروي نيمه سايه

محل خونخواري بالغ: هنگام روز در جنگل هاي سايه دار

استراحت بعد از خونخواري : در اماكن داخلي

خونخواري از روي : انسان و حيوانات اهلي ، ترجيحاَ انسان



9- An. campestris

توضيحات: ناقل مالاريا و فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W. buncrofti و B. malyi )

مناطق انتشار: تايلند و احتمالاَ مناطق جنوب شرقي آسيا، در طول سواحل مالايا

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي نيمه آفتابي، آبهاي عميق داراي مقداري گياه، آبهاي شورمزه، مجاري آب، چاههاي خاكي، گوشه هاي سايه دار مزارع برنج

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در اماكن داخلي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.

10- An. claviger

توضيحات: فقط در خاورميانه ناقل است.

مناطق انتشار : انگلستان و بعضي از كشورهاي اروپايي تا شمال آفريقا، فلسطين، ايران، عراق، افغانستان

نوع لانه لاروي: استخرها، باتلاق ها، چاهها، آب انبارها، آبگيرهاي سنگي، لانه هاي آفتابي يا سايه دار

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن انساني

استراحت بعد از خونخواري : داخل و خارج اماكن انساني

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



11- An. cruzi :

توضيحات: مهمترين ناقل مالاريا در مناطق ساحلي برزيل.

مناطق انتشار: كستاريكا، پرو، برزيل، پاناما، اكوادور، بوليوي، كلمبيا، ونزوئلا

نوع لانه لاروي: آبهاي جمع شده در ميان برگهاي گياه Bromeliade ، لانه هاي لاروي نيمه سايه

محل خونخواري بالغ و استراحت بعد از خونخواري : داخل و خارج اماكن

خونخواري از روي: انسان



12- An. culicifacies

توضيحات: ناقل مهم مالاريا در پاكستان، هند، بنگلادش، سريلانكا

مناطق انتشار: عمان، بحرين، ايران، عرا ق، افغانستان، پاكستان به طرف هند، سريلانكا، اندونزي ، برمه، تايلند

نوع لانه لاروي: انواع آبهاي صاف يا آلوده و گاهي شور، چاهها، باتلاق ها، مزارع برنج، لانه هاي نيمه سايه

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ در داخل ساختمانها

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي را نسبت به انسان ترجيح مي دهد.



13- An. fluviatilis

توضيحات: ناقل مهم مالاريا در پاكستان، هند، بنگلادش

مناطق انتشار : عمان، بحرين، شرق عربستان سعودي، ايران، عرا ق، افغانستان، پاكستان، هند، سريلانكا، برمه ، اندونزي، تايلند، تايوان، ، چين

نوع لانه لاروي: غالباَ در آبهاي جاري از قبيل نهرهاي خاكي، آبگيرها، بستر رودخانه و مجاري آبياري

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : داخل و خارج اماكن

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



14- An. funestus

توضيحات: سومين ناقل مالاريا در دنيا، ناقل فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W. Buncrofti )

ناقل آربوويروسهاي Nyando و Tanga در شرق آفريقا

مناطق انتشار: تمام كشورهاي آفريقايي جنوب صحرا

نوع لانه لاروي: در آبهاي كم و بيش دائمي و داراي گياه و سايه دار، باتلاقها، كنارة نهرها، رودخانه ها

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ در داخل اماكن، ولي در محيط خارجي هم استراحت مي كند

خونخواري از روي: عمدتاَ انسان، حيوانات اهلي را نيز نيش مي زند.



15- An. gambiae

توضيحات: مهمترين ناقل مالاريا در دنيا ، ناقل فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W. Buncrofti)

ناقل آربوويروسهاي Tataguine به انسان در غرب آفريقا

مناطق انتشار: تمام كشورهاي آفريقايي جنوب صحرا

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي موقت مثل آبگيرها، جاي پاي حيوانات، مزارع برنج، چاله ها آب

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ در داخل اماكن، ولي در محيط خارجي هم استراحت مي كند

خونخواري از روي: عمدتاَ انسان، حيوانات اهلي را نيز نيش مي زند.



16- An. labranchiae

توضيحات: در شمال آفريقا ناقل است.

مناطق انتشار : انگلستان و بعضي از كشورهاي اروپايي تا شمال آفريقا، مراكش، الجزاير، تونس

نوع لانه لاروي: آبهاي شور در باتلاق هاي سواحل، باتلاق ها، مزارع برنج، زه آب ها، نهرها

محل خونخواري بالغ : داخل اماكن انساني و حيواني و محيط خارجي

استراحت بعد ازخونخواري : داخل و خارج اماكن انساني و حيواني

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



17- An. letifer

توضيحات: ناقل مالاريا و فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه buncrofti. W)

مناطق انتشار: هند، تايلند، مالزي، فيليپين، اندونزي، سوماترا، برونئو

نوع لانه لاروي: آبهاي راكد به ويژه در دشتهاي ساحلي، آبگيرها، باتلاق ها، لانه هاي لاروي سايه دار

محل خونخواري بالغ: غالباَ پناهگاههاي خارجي

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ پناهگاههاي خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات



18- An. leucosphyrus

توضيحات: ناقل مالاريا در ، سوماترا و ساراواك، گونه جنگلي و وحشي

مناطق انتشار: مالايا، سوماترا، برونئو، ساراواك

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي سايه دار، آبگيرها ي خاكي، جاي چرخ وسايل نقليه، جاي پاي حيوانات

محل خونخواري بالغ: اماكن خارجي

استراحت بعد از خونخواري : اماكن خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



19- An. lesteri

توضيحات: ناقل مهم مالاريا در برخي از مناطق چين، ناقل فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه malayi. B)

مناطق انتشار: كره، تايلند، مالزي، تايوان، فيليپين، جاوه، برونئو، جنوب چين تا ژاپن

نوع لانه لاروي: آبهاي خنك و تميز، آبهاي شورمزه، لانه هاي لاروي سايه دار

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در اماكن داخلي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.

21- An. maculatus

توضيحات: ناقل مالاريا و فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W. buncrofti )

مناطق انتشار: هند، سريلانكا، تايوان، مالزي، فيليپين، اندونزي، برونئو، هندوچين، جنوب چين

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي آفتابي ، زه آبها، آبگيرهاي حاشيه نهرهاي آب ، مزارع برنج،

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ پناهگاههاي خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



22- An. melas

توضيحات: يكي از اسپس هاي آنوفل گامبيه، ناقل مهمي در بسياري از مناطق ساحلي آفريقا.

مناطق انتشار: مناطق ساحلي غرب آفريقا تا كنگو

نوع لانه لاروي: آبهاي شور ، مرداب ها و باتلاق هاي داراي درخت كرنا ( Mangrove )

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ در داخل اماكن، ولي در محيط خارجي هم استراحت مي كند

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



23- An. merus

توضيحات: يكي از اسپس هاي آنوفل گامبيه، ناقل مهمي در بعضي از مناطق ساحلي شرق آفريقا.

مناطق انتشار: مناطق ساحلي شرق آفريقا

نوع لانه لاروي: آبهاي شور ، مرداب ها و باتلاق هاي سواحل

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ در داخل اماكن، ولي در محيط خارجي هم استراحت مي كند

خونخواري از روي : انسان، حيوانات.



24- An. minimus

توضيحات: ناقل مالاريا و فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W. buncrofti )

مناطق انتشار: عمان، سريلانكا، هند، برمه، هندوچين، تايلند، مالزي، تايوان، سوماترا، جاوه، چين، فيليپين

نوع لانه لاروي: غالباَ در آبهاي جاري از قبيل نهرها، چشمه ها، مجاري آبياري، زه آبها، مزارع برنج

محل خونخواري بالغ: بيشتر در اماكن داخلي

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در اماكن داخلي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



25- An. naruna

مناطق انتشار: هند، برمه، تايلند، سريلانكا، تايلند

نوع لانه لاروي: آبهاي راكد، آبگيرها، لانه هاي لاروي آفتابي يا سايه دار، جريان هاي ملايم آب، چاهها

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در اماكن داخلي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



26- An. nigerrimus

مناطق انتشار: هند، سريلانكا، تايلند، مالزي، برمه، برونئو، هندوچين، چين

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي آفتابي، مجاري آبياري، باتلاق هاي داراي گياه، استخرهاي عميق ، مزارع برنج،

محل خونخواري بالغ: غالباَ اماكن خارجي

استراحت بعد ازخونخواري: غالباَ پناهگاههاي خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



27- An. nuneztovari

توضيحات: ناقل مهمي در كشورهاي كلمبيا و ونزوئلا محسوب مي گردد.

مناطق انتشار: گينه، برزيل، بوليوي، كلمبيا، ونزوئلا

نوع لانه لاروي: آبهاي گل آلود، استخرهاي كوچك و آفتابي، آبگيرها، جاي پاي حيوانات

محل خونخواري بالغ: اماكن خارجي

استراحت بعد از خونخواري : در محيط خارجي

خونخواري از روي: حيوانات ولي انسان را هم در محيط خارجي نيش مي زند



28- An. pattoni

مناطق انتشار: چين بالاتر از 30 درجه عرض شمالي

نوع لانه لاروي: لانه هاي لاروي آفتابي، استخرهاي سنگي داراي آلگ، آبگيرهاي اطراف نهرهاي آب

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : اماكن داخلي و خارجي

خونخواري از روي: انسان



29- An. pharoensis

توضيحات: فقط در مصر ناقل مهم محسوب مي گردد.

مناطق انتشار : مصر و قسمت اعظم آفريقا و جنوب صحرا، فلسطين، عربستان سعودي، سوريه

نوع لانه لاروي: باتلاق ها، مزارع برنج، استخرها، استخرهاي داراي گياه

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : در محيط خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



30- An. pseudopunctipennis

مناطق انتشار: جزاير آنتيل، جنوب ايالات متحدة آمريكا تا آرژانتين

نوع لانه لاروي: آبگيرها، كنارة نهرهاي داراي گياه، لانه هاي آفتابي، گودالهاي آب باران، زه آبها

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري: در محيط خارجي

خونخواري از روي : انسان و حيوانات اهلي



31- An. punctimacula

مناطق انتشار : مكزيك ، به طرف آمريكاي مركزي تا پرو ، برزيل ، آرژانتين و ترينيداد

نوع لانه لاروي : آبگيرهاي كوچك، كنارة نهرهاي داراي گياه و سايه دار، باتلاق ها

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري: در محيط خارجي و داخلي

خونخواري از روي : انسان و حيوانات اهلي



32- An. sacharovi

توضيحات: ناقل مالاريا در فلسطين و كشورهاي خاورميانه ، بعنوان زيرگونه maculipennis An.

مناطق انتشار: ايتاليا، يونان، اروپاي شرقي، فلسطين، عربستان سعودي، سوريه، تركيه، ايران، عرا ق

نوع لانه لاروي: باتلاق ها، آبگيرها، آب هاي شيرين يا شور، استخرها ي داراي گياه و آفتابي

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : در داخل اماكن انساني و حيواني

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



33- An. sergentii

توضيحات: ناقل مالاريا در مصر، فلسطين، عربستان سعودي

انتشار: الجزيره، تونس، فلسطين، عربستان سعودي، سوريه، تركيه، ايران، عرا ق، مصر، افغانستان

نوع لانه لاروي: مزارع برنج كاري، زه آبها ، نهرهاي آب با جريان ملايم داراي آفتاب و نيمه آفتابي

محل خونخواري بالغ : داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : در داخل اماكن و پناهگاههاي خارجي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



34- An. sinensis

توضيحات: ناقل مالاريا و فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W.buncrofti و malayi.B )

مناطق انتشار: درياي مديترانه، هند، خاور دور

نوع لانه لاروي: آبهاي خنك و تميز، آبهاي شورمزه، لانه هاي لاروي سايه دار

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در اماكن داخلي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



35- An. stephensi

توضيحات: ناقل مالاريا در مناطق انتشار خود و شهرها و حومة آنها

انتشار: عربستان سعودي، عمان، ايران، عرا ق، افغانستان، بحرين، پاكستان، سريلانكا، هند، برمه، چين

نوع لانه لاروي: آبهاي شيرين يا شور، چاهها، مجاري آب، كناره هاي رودخانه ها، كانالهاي زهكشي

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : غالباَ در داخل ساختمانها

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



36- An. superpictus

انتشار: عربستان سعودي، ايران، عرا ق، افغانستان، اردن، پاكستان، تركيه، يونان، نواحي مديترانه

نوع لانه لاروي: آبهاي جاري، آبهاي كم عمق، بستر رودخانه هاي سنگلاخي، لانه هاي لاروي آفتابي

محل خونخواري بالغ: داخل و خارج اماكن

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در داخل خانه ها و اصطبل ها ، به نسبت كمتر در غارها

خونخواري از روي: انسان، حيوانات.



37- An. sundaicus

توضيحات: ناقل مالاريا و فيلاريازيس ( فرم دوره اي شبانه W.buncrofti )

مناطق انتشار: هند، برمه، هندوچين، تايلند، مالزي، تايوان، سوماترا، جاوه، برونئو، چين، اندونزي

نوع لانه لاروي: آبهاي شور يا شورمزه يا شيرين، مردابها، باتلاقها، آبگيرها، لانه هاي لاروي آفتابي

زه آبهاي مناطق ساحلي داراي آلگ هاي در حال فساد يا گياهان هرزآبي،

محل خونخواري بالغ: اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : بيشتر در اماكن داخلي

خونخواري از روي: انسان، حيوانات اهلي.



38- An. subpictus

توضيحات: ناقل احتمالي مالاريا در جاوه و اندونزي

مناطق انتشار: ايران، پاكستان، هند، برمه، هندوچين، تايلند، مالزي، اندونزي، سريلانكا، جزاير جاوه، چين،

نوع لانه لاروي: آبگيرها ي خاكي نزديك خانه ها، مجاري فاضل آب، گودالهاي خاك برداري، آبهاي شورمزه

محل خونخواري بالغ : اماكن داخلي و خارجي

استراحت بعد از خونخواري : اماكن داخلي و خارجي

خونخواري از روي : انسان، حيوانات.

--------------------------------------------------------

اسامی ۲۳۳ گونه از آنوفل های دنیا



aconitus
albimanus
algeriensis
annandalei
annularis
apicimacula
apoci
aquasalis
arabiensis
ardensis
argenteolobatus
argyritarsis
argyropus
arnoulti
aruni
atroparvus (maculipennis atroparvus)
atropos
austenii
azaniae
azevedoi
aztecus
baezai
balabacensis
barberellus
barbirostris
barbumbrosus
bengalensis
berghei
bradleyi
braziliensis
brohieri
brohieri var. masseguini
brucei
brumpti
brunnipes
buxtoni
bwambae
caliginosus
cameroni
campestris
carnevalei
caroni
carteri
christyi
cinctus
cinereus
cinereus cinereus
cinereus hispaniola
claviger
concolor
confusus
coustani
crawfordi
cristipalpis
culicifacies
culicifacies adenensis
cydippis
dancalicus
darlingi
daudi
deemingi
demeilloni
distinctus
domicola
dthali
dureni
eiseni
erepens
erythraeus
ethiopicus
evansae
faini
farauti
flavicosta
fluviatilis
fontinalis
freeborni
freetownensis
funestus
fuscicolor
fuscivenosus
gambiae
garnhami
gibbinsi
greassei
grenieri
griveaudi
hamoni
hancocki
hargreavesi
harperi
hispaniola
hodgkini
hughi
hyrcanus
implexus
implexus niger
indefinitus
insulaeflorum
interruptus
jebudensis
karwari
keniensis
kingi
kochi
kosiensis
labranchiae (maculipennis labranchiae)
lacani
leesoni
lesteri
letabensis
letifer
listeri
lloreti
longipalpis
lounibosi
lovettae
machardyi
maculatus
maculipalpis
maculipennis (maculipennis maculipennis)
maliensis
marshallii
marteri
martinus (maculipennis martinus)
mascarensis
melanoon (maculipennis melanoon)
materi sogdianus
melas
merus
messeae (maculipennis messeae)
millecampsi
milloti
minimus
montanus
mogholensis
mortiauxi
moucheti
moucheti bervoetsi
moucheti moucheti
mousinhoi
multicolor
murphyi
namibiensis
natalensis
neivai
nigerrimus
nili
nimbus
nitidus
njombiensis
nuneztovari
obscurus
oswaldoi
paludis
parapunctipennis
parensis
pauliani
peditaeniatus
persiensis (maculipennis persiensis)
peryassui
peseudopictus
petragnani
peyrassui
pharoensis
philippinensis
plumbeus
pretoriensis
pseudopunctipennis
pulcherrimus
punctimacula
punctipennis
pursati
quadriannulatus
quadrimaculatus
radama
rageaui
ranci
rhodesiensis
rhodesiensis rhodesiensis
rhodesiensis rupicolus
riparis
rivulorum
rodhaini
roperi
roubaudi
ruarinus
rufipes
rufipes broussesi
rufipes rufipes
sacharovi
salbaii
schwetzi
separatus
sergentii
sergentii macmahoni
sergentii sergentii
seydeli
sinensis
smithii
somalicus
somaliensis
splendidus
squamosus
stephensi
subalpinus (maculipennis subalpinus)
subpictus
sundaicus
superpictus
swahilicus
symesi
tchekedii
tenebrosus
tessellatus
theileri
triannulatus
turkhudi
upemba
vagus
vaneedeni
vanhoofi
vernus
vestitipennis
vinckei
walravensi
wellcomei
wellcomei ugandae
wellcomei ungujae
wellcomei wellcomei
wellingtonianus
whartoni
wilsoni
ziemanni

--------------------------------------------------------

آيين نامه تاسيس و اداره آزمايشگاه هاي تشخيص طبي و آسيب شناسي
متن قانون:
ماده 1 تعريف :
1- آزمايشگاه تشخيص طبي و آسيب شناسي ، موسسه پزشكي است كه طبق ضوابط قانوني ايجاد مي گردد و در آن نمونه هاي حاصل از بدن انسان براي تشخيص و كنترل بيماريها و تاثير درمان مورد آزمايش قرار مي گيرد، هر آزمايشگاه تشخيص طبي نسبت به نوع تخصص و صلاحيت علمي مسئول يا مسئولين فني و براساس مجوزهاي صادره از وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي داراي يك يا چند بخش از بخشهاي زير مي تواند باشد.
الف) بيوشيمي
ب) خون شناسي
ج) ميكروب شناسي ( باكتري شناسي، انگل شناسي،‌ويروس شناسي ،‌ قارچ شناسي)
د) ايمني شناسي و سرم شناسي
ه) آسيب شناسي تشريحي و ياخته شناسي (سيتولوژي و پاتولوژي)
و) ژنتيك پزشكي و مولكولي
ماده 2 تاسيس :
1-2) تاسيس آزمايشگاه قبل از هر گونه اقدام منوط به كسب موافقت اصولي و يا مجوز از وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي مي باشد.
2-2- اجازه تاسيس آزمايشگاه به كساني داده مي شود كه داراي شرايط ذيل باشند:
الف) تابعيت جمهوري اسلامي ايران
ب) نداشتن سوء پيشينه كيفري موثر
ج) دارا بودن يكي از مدارك تعيين شده ذيل:
دكتراي تخصصي آسيب شناسي باليني وتشريحي (يا هردو)
دكتراي تخصصي علوم آزمايشگاهي
دكتراي حرفه اي علوم آزمايشگاهي
دكتراي تخصصي تك رشته اي علوم آزمايشگاهي
تبصره 1- نهادها و موسسات دولتي و يا وابسته به دولت كه از بودجه عمومي استفاده مي نمايند به شرطي مي توانند تقاضاي تاسيس آزمايشگاه نمايند كه داراي مجوز قانوني، اجازه تاسيس موسسات پزشكي قيد باشد
تبصره 2- به موسس ازمايشگاه بيش از يك پروانه تاسيس داده نمي شود
تبصره 3- احراز صلاحيت موسس يا موسسين براساس شرايط فوق الذكر(ماده 2 و تبصره هاي مربوطه) به عهده كميسيون قانوني مصرح در ماده 20 مي باشد.
تبصره 4) در موارديكه موسس آزمايشگاه يك نفر باشد و شخص مزبور فوت نمايد وراث او مي توانند با ارائه گواهي تسليم حصر وراثت و معرفي يك نفر بعنوان مسئول فني واجد شرايط دريافت پروانه به وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي درخواست صدور پروانه مسئوليت فني موقت نمايند. اعتبار اين پروانه به مدت 2 سال خواهد بود. وراث مكلفند ظرف مهلت يادشده با ارائه دادنامه حصر وراثت نسبت به معرفي شخص و يا اشخاص واجد شرايط قانوني دريافت پروانه بعنوان موسس جديد اقدام كنند در غير اينصورت موسسه تعطيل خواهد شد.
د) انتقال پروانه تاسيس به غير توسط موسس ممنوع است مگر با موافقت كميسيون قانوني ماده 20 ضمناً براي افرادي كه يكبار پروانه تاسيس گرفته باشند و بهر علتي به شخص يا اشخاص واجد شرايط ديگري واگذار كرده باشند براي بار دوم پروانه تاسيس صادر نخواهد شد. ولي با رعايت ساير مقررات، پروانه تاسيس يك آزمايشگاه را مي توان به آنها منتقل نمود.
ر) درمانگاهها مي توانند با افزايش بخش آزمايشگاه به پروانه تاسيس مركز مذكور و با معرفي مسئول فني واجد شرايط به دانشگاه ها و موافقت كميسيون قانوني در اين رشته فعاليت نمايند.
ز) كميسيون قانوني با رعايت قوانين مصوب و مفاد اين آييننامه اقدام به بررسي و صدور پروانه خواهد بود. ماده 3 : انتقال بهره برداري،‌ تعطيل 1-3) انتقال آزمايشگاه دائر از يك محل ديگر منوط به موافقت دانشگاه علوم پزشكي وخدمات بهداشتي درماني مقصد با اخذ پروانه تاسيس جداگانه طبق ضوابط مربوطه خواهد بود.
2-3) آزمايشگاه هاي بيمارستانهاي خصوصي مي بايستي در داخل محوطه مربوطه داير گردند و حق نصب تابلوي جداگانه بعنوان آزمايشگاه در محوطه خارج از بيمارستان را ندارند و فقط مي توانند نام آزمايشگاه، نام مسئول فني و تخصص مربوطه رادر تابلوي راهنماي بيمارستان قيد نمايند.
3-3) شروع بكار ، بهره برداري و ادامه فعاليت آزمايشگاه منوط به معرفي كاركنان پزشكي و پيراپزشكي و اعلام تجهيزات موردنياز و ساير مدارك طبق ضوابط اعلام شده توسط دانشگاههاي علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني مربوطه و تاييد كميسيون قانوني آزمايشگاهها و كسب پروانه و رعايت ضوابط قانوني و مقررات مندرج در اين آييننامه و دستورالعمل هاي مربوطه خواهد بود.
4-3) تعطيل آزمايشگاه حداكثر تا شش ماه مجاز است مگر در مورد ماموريتهاي اداري، آموزشي و بيماري كه مورد قبول دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني مربوطه قرار گيرد و در هر صورت موضوع تعطيلي آزمايشگاه بايد به اطلاع دانشگاه مربوطه برسد. چنانچه اين امر رعايت نگردد دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ذيربط مي تواند با توجه به نياز منطقه در محدوده آن آزمايشگاه به فرد ديگري طبق ضوابط و يا اعلام نظر نهايي توسط كميسيون قانوني آزمايشگاهها اجازه تاسيس آزمايشگاه بدهد. تبصره ) افراديكه بدون اطلاع اقدام به تعطيلي آزمايشگاه بيش از دو ماه بنمايند دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ذيربط، مي تواند با توجه به نياز منطقه در محدوده آن آزمايشگاه به فرد ديگري طبق ضوابط اجازه تاسيس آزمايشگاه بدهد.
ماده 4 : شرح وظايف موسس:
1-4) راه اندازي آزمايشگاه حداكثر ظرف مدت 2 سال پس از صدور موافقت اصولي
2-4) معرفي مسئول يا مسئولين فني آزمايشگاه به كميسيون قانوني
3-4) پاسخگويي در برابر مراجع قانوني در همه موارد بجز موارديكه به عهده مسئول فني بوده و در ماه 7 ذكر شده است.
4-4) تامين نيروي انساني واجد شرايط طبق نظر مسئول فني
5-4) اجرا و نظارت بر حفظ شئون اخلاق پزشكي و مقررات كشور
6-4) كنترل و نظارت بر حسن اجراي ضوابط، مقررات و تعرفه هاي مصوب
7-4) همكاري وايجاد تسهيلات لازم براي بازرسي نمايندگان وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي در هر زمان
8-4) ترتيب عمل دادن به توصيه ها و دستورات وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي در جهت حسن انجام امور آزمايشگاه
9-4) رعايت كليه قوانين و مقررات كشور درمورد نحوه اداره اماكن درخصوص نحوه بكارگيري افراد و نحوه پرداخت حقوق قانوني كاركنان
ماده 5- ساختمان آزمايشگاه
ساختمان آزمايشگاه بايد كليه ضوابط مربوط به شرايط فيزيكي يك آزمايشگاه تشخيص طبي را كه توسط وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي تعيين مي شود دارا باشد و در صورتي اجازه بهره برداري صادر مي شود كه بازرسين وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي اين شرايط را احراز نمايند. ماده 6- نيروهاي فني آزمايشگاه :
افراديكه در آزمايشگاه به كارفني مشغول مي شوند به شرح ذيل هستند:
1-6) مسئول فني آزمايشگاه (طبق ماده 7 اين آين نامه)
2-6) كارشناس ارشد باليني، يا كارشناس ارشد يكي از رشته هاي علوم آزمايشگاهي
3-6) كارشناس ازمايشگاه (ليسانس علوم آزمايشگاهي يا رشته هاي وابسته)
4-6) كاردان آزمايشگاه (فوق ديپلم)
5-6) تكنسين آزمايشگاه (ديپلم) كه دوره هاي آموزشي مربوطه را طي كرده باشد و يا پنج سال سابقه خدمت در آزمايشگاه راداشته باشد
تبصره 1) كليه افراد فوق بايد با صلاحديد و موافقت مسئول فني بكار گمارده شوند.
تبصره 2) كليه كادر فني بايد به دانشگاه مربوطه معرفي شوند.
ماده 7: مسئول فني
1-7) مسئول فني بايد داراي يكي از مدارك زير باشد:
دكتري تخصصي آسيب شناسي باليني يا تشريحي (يا هر دو)
دكتراي تخصصي علوم آزمايشگاهي
دكتراي حرفه اي علوم آزمايشگاهي
دكتراي تخصصي تك رشته اي علوم آزمايشگاهي
تبصره ) متخصصين تك رشته اي تنها مسئوليت فني آزمايشگاهي را مي توانند بپذيرند كه در همان رشته فعاليت مي نمايد. در صورتيكه متخصصان تك رشته اي بخواهند مسئوليت فني آزمايشگاه تشخيص طبي را بپذيرند لازم است چهار نفر رشته ، همزمان معرفي شوند.
2-7) مسئول فني توسط موسس يا موسسين به كميسيون قانوني معرفي مي شود و پس از احراز صلاحيت آنها و صدور پروانه مسئوليت فني مي تواند كار خود راشروع نمايد.
تبصره – موسس يا موسسين به شرط دارا بودن شرايط مسئوليت فني مي توانند به عنوان مسئول فني معرفي شوند
3-7) براساس مقتضيات زمان وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي مي تواند بطور موقت شرايط خاصي رابراي مسئوليت فني تعيين و ابلاغ نمايد.
4-7) هر مسئول فني مي تواند مسئوليت فني يك موسسه غيردولتي (اعم از خيريه، شركتها ، نهادها، خصوصي) را دريك نوبت كاري دارا باشد.
پروانه مسئول فني آزمايشگاههاي بيمارستانها و ساير مراكز درماني، به استناد پروانه تاسيس بيمارستان و يا درمانگاه مربوطه صادر خواهد شد.
5-7) صدور پروانه تاسيس مانع از پذيرش مسئوليت فني در آزمايشگاههاي تشخيص طبي براي موسس نخواهد بود.
ماده 8 شرح وظايف مسئول فني:
مسئول فني آزمايشگاه كسي است كه ضمن داشتن تخصص مربوطه، پروانه مسئوليت فني برابر قوانين و مقررات بنام او صادر شده ودخالت وي در امور آزمايشگاه فقط در حد صلاحيت مندرج در پروانه مسئوليت فني و دستورالعملهاي مربوطه آيين نامه مي باشد.
وظايف مسئول فني آزمايشگاه عبارت است از:
1-8- سرپرستي كليه امور تخصصي موسسه
2-8- كنترل و مراقبت وضعيت بهداشتي، تجهيزات و لوازم آزمايشگاهي مواد شيميايي، معرفها و تطبيق همه اين همه اين موارد با استانداردهاي اعلام شده از طرف وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي
3-8- ايجاد هماهنگي لازم بين واحدها و بخشهاي مختلف
4-8- كنترل عملكرد كيفي كاركنان فني
5-8- ممانعت از تحميل هزينه ها و خدمات غير ضروري به بيماران
6-8- رسيدگي به شكايات در مورد امور تخصصي و علمي آزمايشگاه و پاسخگويي به مراجع ذيربط نظير وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي ونظام پزشكي ‌، مراجع قضائي و غيره
7-8- جلوگيري از اعمال پزشكي غيرمجاز
8-8- جمع آوري اطلاعات و آمار مربوط به ارائه كمي و كيفي خدمات وارسال گزارشهاي مربوط به مراجع ذيربط به حسب ضرورت
9-8- رعايت قوانين و مقررات وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي
10-8- اقدام و نظارت بر پذيرش بيماران و ارائه خدمات اوليه به بيماران اورژانسي
11-8- نظارت بر اجراي دقيق برنامه كنترل كيفي داخلي و خارجي و انعكاس و نگهداري آنها در دفاتر مخصوص
12-8- حضور فعال در آزمايشگاه در ساعات مندرج در پروانه
13-8- امضاء ورقه جواب آزمايشها بادر نظر گرفتن كليه شرايط علمي و فني
ماده 9- شرايط ويژه مسئول فني:
1-9) حضور مسئول فني در موسسه در زمان انجام امور فني آزمايشگاه ضروري است و در صورتيكه به هر علت استثنائي مسئول فني نتواند شخصا در زمان تعيين شده در آزمايشگاه حضور داشته باشد، لازم است فردي واجد شرايط و صلاحيت را بصورت موقت به عنوان قائم مقام يا مسئول فني همكار معرفي نمايد. ولي بهرحال مسئوليت تمامي اقدامات رخ داده كماكان به عهده مسئول فني صاحب پروانه خواهد بود.
2-9) مسئول فني مي تواند در سال 2 ماه فرد واجد شرايط را به جانشيني خود بعنوان مسئول فني موقت به دانشگاههاي علوم پزشكي مربوطه معرفي نمايد و اين مدت تا 6 ماه قابل تمديد بوده و در موارد ذيل مدت آن افزايش مي يابد.
الف) ماموريتهاي آموزشي،‌ فرصتهاي مطالعاتي و اداري كه به تاييد وزارت بهداشت،‌ درمان و آموزش پزشكي رسيده باشد.
ب) بيماري خود و يا بستگان درجه يك كه مجبور به ترك شهر و يا شهرستان محل كار خود براي مدت زماني بيشتر از زمان ذكرشده در ماده 2-9 (با تاييد دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ذيربط)
تبصره 1- مسئول فني آزمايشگاه در غياب خود ضروريست فرد واجد شرايط را بعنوان جانشين معرفي نمايد.
تبصره 2- در صورتيكه مسئول فني آزمايشگاه كسي را معرفي ننمايد، موسس يا مسئول فني موسسه محق است كه فرد صاحب صلاحيت را جهت مسئوليت فني به دانشگاه مربوطه معرفي نمايد.
تبصره 3- در صورتيكه مسئول فني آزمايشگاه يك مركز درماني اعم ازبيمارستان يا درمانگاه در غياب خود تا 6 ماه اقدام به معرفي فرد واجد شرايط ننمايد، موسس و يا مسئول فني موسسه اختيار خواهد داشت تا نسبت به معرفي يك نفر واجد صلاحيت براي مسئوليت فني دائم به دانشگاه مربوطه اقدام تا كسب صلاحيت نمايد.
3-9) متخصيصني كه توسط مسئول فني آزمايشگاه بعنوان همكار نيمه وقت و يا تمام وقت آزمايشگاه معرفي و اجازه مربوطه رادريافت مي دارند تا زمان ادامه همكاري ذكر نام آنها روي تابلو و اوراق بلامانع است. اين افراد نيز موظف به حضور در آزمايشگاه در ساعات مقرر مي باشند، بديهي است امضاء ورقه هاي آزمايش صرفاً با امضاء مسئول فني واجد شرايط داراي پروانه معتبر است
4-9) مسئول فني يك آزمايشگاه مي تواند با رعايت همه ضوابط مربوط به مسئوليت فني،‌ همكار يك آزمايشگاه ديگر باشد.
5-9) احكام مسئول فني موقت آزمايشگاه توسط اداره امور آزمايشگاههاي دانشگاهها براساس ضوابط و شرايط فوق الذكر صادر خواهد شد.
ماده 10- شرايط و ضوابط عمومي نحوه كار در آزمايشگاه تشخيص طبي
1-10- نام موسسه ،‌ آدرس و تلفن و ساعات كار بايد روي ورقه آزمايشگاه منعكس شود ضروريست نام مسئول فني و شماره نظام پزشكي بر روي ورقه هاي آزمايشگاه قيد شود.
2-10- آزمايشگاه موظف به داشتن دفتر كل و گزارش رايانه اي بيماران جهت ثبت نام بيماران و مشخصات كامل آنها و نام پزشك درخواست كننده، نوع آزمايشهاي درخواستي، قيمت، شماره سريال قبض نوع بيمه و تاريخ مي باشد.
3-10- كليه دفاتر آزمايش بايد حداقل به مدت يكسال در آزمايشگاه بايگاني شود . هريك از بخشهاي آزمايشگاه بايد دفتر جداگانه اي جهت ثبت نتيجه هاي آزمايش بيماران داشته باشد.
4-10- آزمايشگاه موظف به صدور قبض رسيد در مقابل دريافت وجه از بيماران بوده ورونوشت و يا ته قبض آن رابايد به مدت شش ماه نگهداري نمايد.
5-10- استاده از هر گونه نام و عناوين روي تابلو و ورقه هاي آزمايشگاه به غير از آنچه در پروانه قيد شده است ممنوع مي باشد.
6-10- نمونه برداري در آزمايشگاه بايد طبق ضوابط علمي صورت گرفته و مفاد آيين نامه انطباق امور اداري و فني موسسات پزشكي با موازين شرع مقدس دقيقاً رعايت شود.
7-10- آزمايشگاه موظف است به تناسب امكانات علمي و فني خود آزمايش بپذيرد.
8-10- تعداد آزمايشگاه موردنياز در هر شهر و فاصله آنها از همديگر براساس جمعيت، وسعت، پراكندگي جمعيت و ساير موضوعات توسط گروه كارشناسي متشكل از نمايندگان اداره امور آزمايشگاههاي دانشگاههاي علوم پزشكي شهرستانها و هماهنگي اداره امور آزمايشگاهها خواهد شد.
تبصره 1) آزمايشگاههاي بيمارستاني از اين بند مستثني هستند.
9-10- ظرفيت بايد براساس كل پذيرش انجام گرفته و نبايد هيچگونه تفاوتي بين بيماران بيمه اي و غيربيمه اي باشد وتنها پذيرش بر مبناي حق تقدم مراجعين مي باشد.
تبصره : بيماران اورژانس مستثني از اين قاعده هستند.
10-10- هر آزمايشگاه موظف است نرخ تعرفه خدمات آزمايشگاهي رادر مكاني مناسب و در محلي كه در معرض ديد همگان باشد نصب نمايد.
11-10- چون اجراي كنترل كيفي (داخلي و خارجي) براي آزمايشگاههاي كشور جزء وظايف اوليه محسوب شده است لذا در اجراي اين هدف آزمايشگاهها موظف به اجراء برنامه كنترل كيفي و نيز شرايط و ضوابط تعيين شده در طرح استاندارد سازي آزمايشگاههاي تشخيص طبي مي باشند.
ماده 11- شرايط و ضوابط عمومي نحوه كار در آزمايشگاههاي آسيب شناسي تشريحي(هيستوپاتولوژي) 1-11- كليه نسوج برداشته و مايعات خارج شده از بدن بيماران بايد براي آزمايشهاي هيستوپاتولوژي و سيتولوژي به آزمايشگاههاي مجاز براي انجام آزمايشهاي لازم ارسال گردد.
2-11- آزمايشگاه آسيب شناسي تشريحي بايد جهت آزمايش نمونه ارسالي، اطلاعات لازم شامل درخواست پزشك معالج، نام ونام خانوادگي بيمار- نام پدر- سن- جنس- محل برداشت نمونه و تاريخ برداشت آن- اطلاعات اساسي از شكايات و علائم باليني و آزمايشگاهي، مشاهدات حين بيوپسي و يا عمل جراحي و تشخيص يا تشخيص هاي افتراقي را اخذ و سپس به آزمايش اقدام نمايد.
در مورد نمونه هاي مربوط به دستگاه توليد مثل بانوان، وضع زنانگي، تاريخ آخرين قاعدگي و قاعدگي ماقبل و استفاده از هورمون ها نيز بايستي ذكر شود.
3-11- مشخصات بيمار، نام و نام فاميل، نام پزشك معالج و محل برداشت نمونه بايد روي ظرف حاوي نمونه بطور جداگانه و با مسئوليت پزشك معالج نوشته شود و با ورقه درخواست آزمايش تطبيق نمايد.
تبصره : جراح و يا پزشك معالج موظف است كه تمامي نمونه را با ذكر تمام مشخصات نمونه و بيمار فقط براي يك آزمايشگاه ارسال دارد ونبايستي نمونه مورد آزمايش به قطعاتي تقسيم و براي آزمايشگاههاي متعدد فرستاده شود، در صورت كشف اين موضوع آزمايشگاه مي تواند از پذيرش آن خودداري نمايد.
در صورتيكه كشف اين موضوع پس از برش و طي مراحل مختلف تكنيكي و قبل از دادن جواب آسيب شناسي باشد. آسيب شناس مخير است كه بقيه نمونه و لامهاي تهيه شده را پس از دريافت هزينه هاي مربوطه به صاحب آن مسترد نمايد و يا مانند هربيوپسي ديگري آزمايش ميكروسكوپي انجام داده وجواب آنرا بدهد.
ماده 12- شرايط ويژه آزمايشگاههاي آسيب شناسي تشريحي و ياخته شناسي(سيتولوژي)
الف- مسئول فني اين آزمايشگاه ها بايد داراي درجه دكترا در پزشكي ودرجه تخصصي در پاتولوژي تشريحي باشد.
ب- جواب پاتولوژي و سيتولوژي بايد حداقل دردو نسخه گزارش شود كه نسخه اصلي به بيمار داده شده يابراي پزشك معالج ارسال مي گردد و نسخه دوم در آزمايشگاه بايگاني مي شود.
ج- كليه بلوكها بايد براي هميشه در بايگاني آزمايشگاه نگهداري شود.
د- كليه لامهاي پاتولوژي بايد حداقل بمدت 10 سال در آزمايشگاه نگهداري شوند.
هـ - كليه لامهاي سيتولوژي بايد حداقل بمدت 6 ماه در آزمايشگاه نگهداري شوند و موارد مثبت يا مشكوك بايستي براي هميشه در آزمايشگاه نگهداري شوند. كپي نتايج گزارش همراه بادرخواست آزمايشات پاتولوژي حداقل 2 سال نگهداري شوند.
ز- كليه نمونه ها بايد با شماره اي مشخص شوند و در دفتر انديكس ، روي نمونه، روي لامها، روي بلوكها و در برگه گزارش اين شماره منعكس شود.
ح- نام، فاميل، نام پدر، سن و جنس بيمار و نام پزشك معالج و نيز تاريخ صدور جواب، محل برداشت و نوع بافت مورد آزمايش بايد در ورقه گزارش شود.
تبصره – مسئوليت دادن اين اطلاعات و صحت آن بعهده پزشك معالج است.
ط- نوع فيكساتور مصرف شده بايد ذكر شود.
ي- شرح ماكروسكوپي در گزارش لازم است و بايد مشخص شود كه بافت تماما يا قسمتي از آن مورد بررسي قرار گرفته است.
ك- تشخيص نهايي بايد بطور مشخص در گزارش منعكس گردد.
ل- ذكر نام پاتولوژيست همراه با امضاي وي در گزارش الزامي است.
م- در صورتي كه پزشك معالج مايل به اخذ نظر مشورتي ديگري باشد با درخواست كتبي،‌ آزمايشگاه موظف است لامهاي موردنظر و يا درصورت لزوم بلوكها را دراختيار پزشك معالج قرار دهد. آزمايشگاه مورد مشورت بايد لامهاي موردنظر را شماره گذاري نمايد و همانند نمونه هاي ديگر گزارش و نگهداري نمايد، ولي بلوكها حتما به آزمايشگاه اول برگشت داده شوند. در صورتيكه به علل تكنيكي تنها در يك لام ضايعه ديده شود لام مذكور پس از مشاوره به آزمايشگاه اوليه عودت داده شود.
ماده 13- ضوابط مربوط به لغو موقت دائم پروانه آزمايشگاه
موسس و يا موسسين آزمايشگاه موظفند الزامات موضوع اين آيين نامه و دستورالعملهاي ابلاغ شده توسط وزارت بهداشت،درمان وآموزش پزشكي را رعايت نمايند و مسئول فني و كاركنان ذيربط نيز مكلف به انجام آنها در حدود وظايف و صلاحيتهاي مربوطه هستند و بايد نواقص اعلام شده رادر مدت زمان تعيين شده برطرف سازند و در صورت تخلف بسته به نوع تخلف به نحو زير اقدام خواهد شد.
الف) تذكر شفاهي با قيد موضوع در صورتجلسه كارشناسي محل توسط دانشگاههاي علوم پزشكي وخدمات بهداشتي درماني ذيربط
ب) اخطار كتبي و درج در پرونده توسط دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ذيربط
ج) لغو موقت پروانه تاسيس و تعطيل آزمايشگاه بمدت يكسال به پيشنهاد دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني با نظر مراجع قانوني ذيصلاح در استانها
د) لغو دائم پروانه تاسيس آزمايشگاه به پيشنهاد دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني با تصويب معاونت درمان و نظر مراجع قضائي ذيصلاح
ماده 14- اين آيين نامه باستناد قانون مربوط به مقررات امورپزشكي و دارويي موادخوراك و آشاميدني مصوب 29/3/1334 و اصلاحيه سال 23/1/1367 و قانون تشكيلات وظايف وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشكي مصوب سال 1367 در تاريخ 28/1/78 به تصويب رسيد و كليه آيين نامه ها و دستورالعملها و بخشنامه هاي مغاير با آن از تاريخ اجراء اين آيين نامه لغو مي گردد.

در کلونینگ ژن برای انتقال ژن مورد نظر به سلول میزبان معمولاً لازم است که آن را وارد یک ناقل یا وکتور DNA ای کنند.


برای آنکه یک مولکول DNA به عنوان وکتور قابل استفاده باشد باید دارای مجموعه‌ای از خصوصیت باشد، شامل:
1. همانندسازی مستقل از سلول میزبان داشته باشد. به این دلیل که بتواند سریعتر از تقسیم سلولی تکثیر شود تا در نهایت نسخه‌های زیادی از آن تولید شود.
2. در هنگام تقسیم سلولی به سلول‌های دختری ( سلول‌های حاصل از تقسیم ) انتقال یابد.
3. اندازه‌ی کوچک در حدود 10 کیلوباز داشته باشد، چراکه مولکول‌های بزرگتر از این مقدار ممکن است در طی مراحل تخلیص و کلونینگ خرد شود و دستورزی آن نیز مشکل است.
از معدود مولکول‌های DNA ای که این ویژگی‌ها را دارا می‌باشند پلاسمیدها اند.

باکتری‌ها علاوه بر کرومزومشان دارای مولکول‌های DNA دو رشته‌ای، حلقوی و کوچکی هستند که قادر به همانندسازی مستقل از کرومزوم‌ باکتری می‌باشند. پلاسمید‌ها معمولاً حاوی 1 یا چند ژن می‌باشند که سبب ایجاد خصوصیات ویژه‌ای در سلول میزبانشان می‌شوند. پلاسمیدها را براساس نوع ژنشان گروه‌بندی کرده‌اند:
1. پلاسمیدهای بارور که به آنها F پلاسمید می‌گویند این پلاسمیدها حاوی ژنی اند به نام ژن tra که سبب انتقال اطلاعات ژنتیکی از طریق همیوغی به باکتری دیگر می‌شوند.
2. پلاسمیدهای مقاومت یا R پلاسمیدها که حاوی ژن‌های مقاومت به یک یا چند آنتی بیوتیک اند این پلاسمیدها در میکروبیولوژی بالینی مورد توجه‌اند چراکه فراوانی آنها در جمعیت باکتری‌ها، در انتخاب آنتی بیوتیک و درمان بیماری‌های عفونی اثر دارد.
3. پلاسمیدهای کشنده یا کولیسن سبب تولید پروتئین‌هایی می‌شود که برای باکتری‌های دیگر کشنده‌اند.
4. پلاسمیدهای بیماریزا مانند پلاسمید Ti در ارگوباکتریوم تومفسیانس که باعث گال در گیاهان دولپه‌ای می‌شود.
5. پلاسمیدهای تجزیه کننده که امکان تجزیه‌ی مولکول‌های غیر طبیعی نظیر تولوئن را به باکتری می‌دهند.
در کلون ژن، از خصوصیت مقاومت به آنتی‌بیوتیک به عنوان یک نشانگر انتخابی استفاده می‌کنند. نشانگر انتخابی در گزینش کلونی‌هایی که ‌DNA نوترکیب را دریافت کرده‌اند مورد استفاده قرار می‌گیرند.
باکتریوفاژها دسته‌ای دیگر از مولکول‌های DNA ای می‌باشند که به عنوان وکتور کلونینگ مورد استفاده قرار می‌گیرند. باکتریوفاژها ویروس‌هایی اند که باکتری‌ها را به طور اختصاصی آلوده می‌کنند.

فاژها مانند سایر ویروس‌های از یک بخش وراثتی، که شامل مولکول داکسی ریبونوکلئیک اسید(DNA) و یا ریبونوکلئیک اسید(RNA) است، و یک پوشش محافظتی پروتئینی به نام کپسید ساخته شده. ماده‌ی وراثتی فاژها در برگیرنده‌ی ژن‌هایی است که آنزیم‌های دخیل در تکثیر فاژ و پروتئین‌های سازنده‌ی کپسید را کد می‌کنند.
به طور کلی، برای آلوده سازی باکتری، ذره‌ی فاژی به دیواره‌ی باکتری می‌چسبد و ماده‌ی ژنتیکی‌اش را به درون سلول باکتری تزریق می‌کند. سپس مولکول DNA فاژی همانندسازی می‌کند و بعد از ساخت اجزای سازنده‌ی باکتری، ذرات فاژی جدید تشکیل می‌شود و سرانجام سلول لیز می‌شود که سلول را لیز می‌کنند و آزاد می‌شوند.

 

فاژ لاندا

همان طور که در قسمت اول گفته شد از باکتریوفاژها نیز می‌توان به عنوان ناقل DNA هدف ژن کلونینگ استفاده کرد. از جمله فاژهای مورد استفاده در مهندسی ژنتیک، فاژ لاندا است که باکتری اشرشیاکولی را آلوده می‌کند.


وکتور‌هایی که از باکتریوفاژ لاندا ساخته می‌شوند برای کلون کردن قطعات DNA بزرگتر از 25 کیلوباز مناسب‌تر از وکتورهای پلاسمیدی اند. از این رو استفاده از وکتورهای مشتق از فاژ لاندا برای ساخت کتابخانه‌ی ژنومی ( مجموعه‌ی جامعی از قطعات DNA یا mRNA رونویسی شده از روی آنها، که نماینده‌ی ژنوم موجودات است) متداول‌تر است.
نحوه‌ی آلوده‌سازی فاژ لاندا به دو صورت می‌تواند باشد:
1. چرخه‌ی لیتیک- در این نوع رشد DNA فاژ در سلول باکتری همانندسازی می‌کند وبلافاصله سنتز پروتئین‌های ساختمانی ( پروتئین‌های تشکیل دهنده‌ی کپسید یا پوشش ویروسی) از روی آن آغاز می‌شود و اجزای تشکیل دهنده‌ی فاژ ( پروتئین‌های کپسید و DNA فاژی ) با هم جمع شده و تشکیل یک فاژ کامل جدید را می‌دهند. ذرات فاژی جدید با تخریب سلول باکتری آزاد می‌شوند.
2. چرخه‌ی لیزوژنیک- برخلاف چرخه‌ی لیتیک، که DNA فاژ در سلول باکتری باقی نمی‌ماند، در چرخه‌ی لیزوژنیک DNA فاژی به درون کرومزوم باکتری وارد می‌شود در این حالت به آن پروفاژ می‌گویند که شکل غیرفعال فاژ است. باکتری که به این صورت آلوده شده است را لیزوژن می‌گویند که از نظر ظاهری تفاوتی با باکتری‌های آلوده نشده ندارد. در حالت لیزوژنیک، فاژ باکتری را تخریب نمی‌کند و باکتری قادر به ادامه‌ی حیات خود است. زمانی که پروفاژ از کرومزوم باکتری خارج شود فعال می‌شود و چرخه‌ی لیتیک را آغاز می‌کند که در نهایت سبب تخریب سلول باکتری می‌شود. در شکل زیر نحوه‌ی آلوده ساز فاژ لاندا نشان داده شده:

فاژ لاندا شامل یک سرچندوجهی -که ‌ DNA فاژ در آن واقع شده- و یک دم -که با اتصال به دیواره‌ی باکتری در تزریق DNA فاژ به باکتری نقش دارد- می‌باشد. لانداDNA چهل و نه کیلوبازی و دورشته‌ای است و یک نسخه از آن به صورت خطی در قطعه‌ی سر فاژ قرار گرفته.
نکته‌ی جالب در مورد ژنوم لاندا وجود دو انتهای چسبنده مکمل در طرفین مولکوی خطی ‌DNA است. این دو انتهای چسبنده می‌توانند با یکدیگر تشکیل پیوند دهند و مولکول به شکل حلقوی مبدل شود.
ژنوم لاندا پروتئین‌های سازنده‌ی سر و دم، پروتئین‌های دخیل در همانندسازی و پروتئین‌های فعال کننده‌ی چرخه‌ی لیتیک را کد می‌کند. یکی از خصوصیات نقشه‌ی ژنتیکی لاندا این است که ژن‌هایی که در فعالیت‌های مشابه شرکت دارند در کنار یکدیگر واقع شده‌اند. می‌توان 4 منطقه روی آن تعریف کرد که به ترتیب قرارگیری عبارتند از: منطقه‌ی سری ( ژن‌های پروتئین‌های سازنده‌ی سر)، منطقه‌ی دمی ( ژن‌های پروتئین‌های سازنده‌ی پروتئین‌های دمی) منطقه‌ی همانندسازی، منطقه‌ی لیتیک.
ناحیه‌ی مرکزی ژنوم لاندا حاوی ژن‌های غیر ضروری در روند آلوده‌سازی سلول باکتری است که آن را خارج می‌نمایند و قطعه‌ی DNA خارجی را به جای آن وارد می‌کنند. این ناحیه‌ی غیرضروری شامل ژن‌هایی است که در وارد شدن فاژ به کرومزوم باکتری و خارج شدن پروفاژ از ژنوم باکتری فعالیت می‌کنند.


حذف این ناحیه از دو جهت سودمند است:
1. اندازه‌ی فاژ کوچک می‌شود و امکان اضافه نمودن DNA جدید با اندازه‌ی 25 کیلوباز را به ما می‌دهد.
2.حذف این ناحیه فاژ را غیر لیزوژنیک کرده و باعث می‌شود فاژ چرخه‌ی آلوده‌سازی لیتیک را دنبال کند و دیگر نیازی به القای فاژ برای تبدیل فاژ لیزوژنیک به لیتیک نیست.
بعد از وارد کردن قطعه DNA خارجی به ژنوم فاژ، آن را در پوشش فاژ بسته بندی می‌کنند و در مجاور باکتری‌های اشرشیاکولی قرار می‌دهند تا آلوده‌سازی صورت گیرد. باتخریب سلول باکتری پلاک‌‌هایی در محیط کشت حاصل می‌شود به این ترتیب کلونی‌های نوترکیب قابل شناسایی اند و دیگر نیاز به استفاده از نشانگر انتخابی، که در هنگام استفاده از پلاسمیدها لازم بود، نیست.
برای آنکه ژنوم نوترکیب لاندا در ساختمان سر فاژ قابل بسته بندی باشد کل اندازه‌ی آن نباید بیشتر از 52 کیلوباز باشد. در غیر اینصورت بسته بندی انجام نشده و ذرات فاژی آلوده کننده تشکیل نمی‌شوند.
برای رفع نواقص این نوع وکتور و کارایی بیشتر، مهندسین ژنتیک با ایجاد تغییراتی وکتورهای مختلفی از آن ساخته ‌اند.

 

فاژ M13

M13 یک باکتریوفاژ رشته‌ای است که متشکل است از DNA تک رشته‌ای حلقوی با طول 6.4 (6404 نوکلئوتید) که با کپسیدی حاوی حدود 2700 نسخه پروتئین P8 (پروتئین اصلی تشکیل دهنده‌ی کپسید) و 5 تا 8 نسخه از پروتئین P3 که در بخش تحتانی ساختمان فاژ واقع شده است.

M13 باکتری اشرشیاکولی را آلوده می‌کند. نحوه‌ی ورود M13 به سلول میزبان از طریق پیلی (pili) است. پروتئین P3 به گیرنده‌‌های واقع در نوک پیلوس¹ متصل شده و سبب تزریق ‌DNA ویروس به میزبان می‌شود.
چرخه‌ی آلوده سازی M13 غیر لیتیک² است و از این رو عفونت با آن برای میزبان کشنده نیست. از طرفی DNA تک رشته‌ای M13 وارد کرومزوم باکتری نمی‌شود و چرخه‌ی لیزوژنیک را دنبال نمی‌کند.

DNA تک رشته‌ای حلقوی M13 حاوی 10 ژن است برخی از این ژن‌ها به شرح زیر است:
• ژن II آنزیم نیکاز، که در همانندسازی چرخه‌ی غلتان نقش دارد را کد می‌کنند.
• ژن III پروتئین P3 را کد می‌کنند که ورود ژنوم فاژ را به سلول میزبان، رهبری می‌کنند.
• ژن VIII که P8 را کد می‌کند که سازنده‌ی اصلی پوشش ویروس است.
M13 در طی چرخه‌ی آلوده سازی خود دو نوع روش همانندسازی را ممکن است در پیش بگیرد:
1. مولکول تک رشته‌ای به عنوان الگو برای سنتز رشته‌ی مکملش قرار می‌گیرد و DNA دو رشته‌ای حلقوی تشکیل می‌شود که فرم تکثیری ژنوم M13 می‌باشد.
2. ذرات فاژی جدید به طور مداوم تشکیل می شوند و از سلول خارج می‌شوند. برای آنکه ذرات فاژی جدید تشکیل شود از طرق همانندسازی چرخه‌ی غلتان، DNA حلقوی تک رشته‌ای ایجاد می‌شود.
در همانندسازی چرخه‌ی غلتان، فرم تکثیری ( فرم دو رشته‌ای حلقوی ) از طریق آنزیم نیکاز،که توسط ژن II کد می‌شود، در یکی از رشته‌ها شکاف ایجاد می‌شود که سبب فراهم شدن دو انتهای آزاد 3" هیدروکسیل و 5" فسفات می‌شود. از آنجا که آنزیم DNA پلیمراز برای ردیف کردن نوکلئوتیدها به انتهای آزاد 3" هیدروکسیل به عنوان سوبسترا نیاز دارد، عمل آنزیم نیکاز این سوبسترا را برای آنزیم فراهم می‌کند. رشته‌ی بریده نشده به عنوان الگوی همانندسازی خواهد بود. در شکل زیر دو نوع همانندسازی نشان داده شده است:
اگر M13 را با فاژ لاندا مقایسه کنید متوجه‌ی ویژگی‌های منحصربه فرد آن می‌شوید برای مثال داشتن DNA حلقوی تک رشته‌ای که طول آن خیلی کوچکتر از ژنوم لانداست و این بدین معنی است که تعداد ژن‌های M13 کمتر است، به این علت که تعداد پروتئین‌های سازنده‌ی پوشش M13 تنها 3 نوع است در حالیکه در ساختمان سری دمی لاندا 15 نوع پروتئین وجود دارد.

از جمله خصوصیاتی که M13را مورد توجه مهندسان ژنتیک و طراحان وکتور قرارداده است به قرار زیر است:
• اولین خصوصیت، اندازه‌ی ژنوم M13 است. طول کمتر از 10 کیلوباز اندازه‌ی بسیار مطلوبی برای یک وکتور است، که در قسمت قبل این مجموعه علت آن بیان شد.
• ویژگی منحصر به فرد M13، فرم تکثیری دو رشته‌ای و نحوه‌ی همانندسازی آن است. فرم تکثیری M13 شبیه پلاسمید است و می‌توان مانندپلاسمید، وکتور حاصل از آن را از سلول میزبانش خالص نمود و مجدداً به باکتری وارد نمود.
یک ویژگی مهم و استثنایی وکتورهای حاصل از M13 توان بالقوه‌ی آن برای ایجاد DNA تک رشته‌ای از طریق همانندسازی چرخه‌ی غلتان است. تولید ژن کلون شده‌ی تک رشته‌ای برای برخی از اهداف از قبیل توالی یابی، ایجاد جهش به منظور بررسی‌های تکاملی و یا تولید پروتئین‌های با ویژگی‌های برتر، مورد توجه است.

1. پیلوس ساختار است که باکتری از طریق آن همیوغی جنسی انجام می‌دهد. پلاسمید F که حامل فاکتور بارور سازی است کد کننده‌ی پروتئین‌های لازم برای پیلوس همیوغ کننده‌ی اشرشیاکولی است.
2. چرخه‌ی لیتیک سبب لیز شدن سلول میزبان و مرگ آن می‌شود.

کلونینگ ژن ترنسفورماسیون

بعد از تهیه‌ و طراحی ناقل مناسب و اتصال ژن مورد نظر به آن، DNA نوترکیب باید وارد سلول زنده شود تا با استفاده از دستگاه همانندسازی موجود در سلول، ژن هدف تکثیر و بیان شود.


عمل انتقال DNA نوترکیب به سلول زنده «ترنسفورماسیون» است و موجودی که از این طرق DNA نوترکیب را دریافت می‌کند تراریخت یا ترنسژنیک(Transgenic) نام دارد.

سلول‌هایی که معمولاً به عنوان پذیرنده‌ی مولکول نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرند، باکتری‌ها هستند چراکه رشد و تکثیر در باکتری‌ها به سرعت صورت می‌گیرد و کشت‌ آنها نیز ساده‌تر و ارزان‌تر است.
اکثر گونه‌های باکتریایی توانایی جذب مولکول DNA از محیط اطرافشان را دارند.‌ DNA خارجی در باکتری اغلب تجزیه می‌شود اما در صورت داشتن جایگاه شروع همانندسازی قابل شناسایی توسط سیستم همانندسازی باکتری، می‌تواند در سلول میزبان باقی بماند و تکثیر شود.
قدرت جذب DNA خارجی برای همه‌ی باکتری‌ها به یک میزان نمی‌باشد. به عنوان مثال باکتری اشرشیاکولی، که پرکاربردترین باکتری در مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی میکروبی است، در شرایط عادی قدرت جذب کمی دارد و میزان وقوع تراریختی در این شرایط مطلوب نخواهد بود. از این رو برای بهینه سازی میزان تراریختی باید باکتری را تحت تیمارهای خاصی قرار داد تا قدرت جذبش افزایش یابد.
در دهه‌ی 1970 با مشاهده‌ی اینکه سلول‌های ای.کولای خیسانده شده در محلول نمکی بسیار سرد، نسبت به سلول‌هایی که با محلول نمکی تیمار نشده اند، DNA را خیلی بهتر جذب می‌کنند، راه حل مشکل موجود در مرحله‌ی ترنسفورماسیون یافت شد. به این ترتیب که باکتری‌ها را در محلول کلرید کلسیم یا کلرید ربیدیوم با غلظت 50 میکرومولار قرار می‌دهند و سپس DNA نوترکیب را به باکتری تیمار شده می‌افزایند.
کلرید کلسیم تنها سبب اتصال DNA به دیواره‌ی باکتری می‌شود و به طور مستقیم در جذب DNA نقش ندارد. برای جذب واقعی DNA به درون سیتوپلاسم باکتری، آن را در معرض شوک حرارتی قرار می‌دهند که سبب افزایش نفوذپذیری دیواره‌ی باکتری می‌شود. حرکت DNA به درون باکتری با بالا بردن دمای انکوباتور تا 42°C تسریع می‌شود.
گام بعدی در کلونینگ ژن، شناسایی تراریخت‌ها است. از آنجا که در مرحله‌ی تولید DNA نوترکیب، تقریباً کنترلی در نحوه‌ی اتصال قطعه‌ی DNA به مولکول ناقل وجود ندارد، در پایان مرحله مخلوطی از انواع اتصال‌ها، از جمله؛ مولکول ناقل فاقد قطعه‌ی DNA ، قطعات DNA هدف متصل نشده به ناقل و مولکول‌های ناقلی که به صورت نامطلوب تولید شده اند، حاصل خواهد شد. همچنین در مرحله‌ی ترنسفرماسیون برخی سلول‌ها DNA نوترکیب را دریافت نمی‌کنند و کلونی حاصل از رشد آنها ژن مورد نظر را دربر ندارد. از این رو لازم است تا کلونی‌هایی که DNA نوترکیب مطلوب را دریافت کرده‌اند به طریقی شناسایی شوند. برای این منظور مهندسان ژنتیک، تکنیک‌های مختلف طراحی وکتورها یا ناقل‌های مورد استفاده در کلونینگ را متناسب با هدفی که در کلونینگ ژن دنبال می‌کنند، مورد استفاده قرار می‌دهند که در بخش دیگری به توضیح آن می‌پردازیم.

کلونینگ DNA کاربردهای متعددی دارد که در مجموع به آنها «مهندسی ژنتیک» گفته می‌شود که از آن جمله تعیین توالی ژنوم موجودات است که راه را برای تعیین توالی پروتئین‌های موجودات و استفاده از آن در مطالعه‌ی عملکرد پروتئین‌ها و مهندسی پروتئین می‌گشاید.
همچنین در تهیه‌ی «اثر انگشت DNA » برای تشخیص هویت، تشخیص بیماری‌های وراثتی، ژن درمانی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، ایجاد موجودات تراریخت، تولید انبوه تجاری پروتئین‌های مختلف از جمله انسولین انسانی، هورمون رشد و آنزیم‌های مورد استفاده در صنعت کاربرد دارد. 

ناقل‌هاي ژن کلونينگ براي يوکاريوت‌ها
پلاسميد 2 ميکرومتري

در قسمت‌هاي قبل 3 نوع از حاملين يا ناقل‌هاي ژني مورد استفاده در باکتري اشرشياکولي که شامل پلاسميد باکترياي، فاژ لاندا و فاژ M13 بود را معرفي کرديم.

در بيشتر مطالعات ژنتيکي و زيست مولکولي مثل مطالعه‌ي ساختار و فعاليت ژن‌ها از اي.کولاي که يک پروکاريوتي است به عنوان ميزبان استفاده مي‌شود به طوري که حامل‌هاي ژني متنوعي براي آن طراحي و ساخت شده است.

اما براي برخي از اهداف بيوتکنولوژي، نظير خلق GMOها، استفاده از يک ميزبان يوکاريوت ضرورت مي‌يابد. با توجه به تفاوت‌هاي دستگاه‌‌هاي بيان ژن و ويرايش RNA که در سلول‌‌هاي پروکاريوتي ( شامل تمام باکتري‌ها) و يوکاريوتي(شامل سلول‌هاي گياهي، جانوري و انواع آغازيان) وجود دارد بنابراين لازم است حامل‌هاي ژني ديگري را به کار برد.
مخمر ساکرومايسس سروزيه، که مخمر مورد استفاده در تخمير و نانوايي است، يکي از مهمترين موجودات در بيوتکنولوژي مي‌باشد.
ساکاورومايسس سروزيه گونه‌اي مخمر جوانه‌اي است که داراي تکثير غير جنسي، به طريق جوانه زدن است. اين مخمر از گذشته‌ي دور مفيدترين مخمر براي بشر بوده است چرا که در تخمير خمير نان و الکل سازي نقش اساسي دارد.

امروزه اين تک ياخته‌ي يوکاريوتي علاوه بر کاربرد سنتي خود به عنوان يک ميزبان يوکاريوتي براي توليد محصولات دارويي نوترکيب و پروتئين‌هاي يوکاريوتي از ژن‌هاي کلون شده اهميت ويژه‌اي يافته است. لذا تلاش‌ها زيادي براي ساخت حاملين ژني براي اين مخمر صورت گرفته است.
با کشف پلاسميدي به نام پلاسميد 2µm در مخمر، که از معدود پلاسميد‌هاي يافت شده در سلول‌هاي يوکاريوت است، پيشرفت در ساخت انواع ناقلين کلونينگ براي مخمر، تسريع شد.
پلاسميد 2µm که در اکثر سويه‌هاي ساکرومايسس سروزيه يافت مي‌شود و 70 تا 200 نسخه از آن در سلول مخمر موجود مي‌باشد در واقع خود اساس و منشا ساخت انواع ناقل‌هاي کلونينگ يوکاريوتي‌ است.
پلاسميد 2µm به اندازه‌ي 6 کيلوباز مي‌باشد که اين اندازه براي يک حامل ژني بسيار مطلوب مي‌باشد. همانندسازي پلاسميد 2µm، برخلاف همانندسازي پلاسميدهاي باکتريايي، کاملاً تحت کنترل سيکل تقسيم سلولي است و دستگاه پروئيني که اين پلاسميد و کرومزوم‌هاي مخمر را همانندسازي مي‌کند يکسان است و پروتئين‌هاي آن توسط ژن‌هاي هسته‌اي کد مي‌شوند.
پلاسميد 2µm به طور کامل تعيين توالي و ژن‌هاي آن مشخص شده است. اين پلاسميد داراي يک جايگاه شروع همانندسازي، و 4 ژن به نام‌ها REP1, REP2, FLP1 و D است. پروتئين حاصل از REP1, REP2 در تکثير پلاسميد دخالت دارند و پروتئين کد شده توسط ژن FLP1 با ايجاد نوترکيبي درون مولکولي ترتيب ژني را بازآرايي مي‌کند.
با وجودي که اندازه‌ي کوچک اين پلاسميد و همچنين فراوانيش در سلول‌هاي مخمر، آن را گزينه‌ي مناسبي براي کاربرد‌هاي مهندسي ژنتيک کرده است اما استفاده از آن چندان هم بي دردسر نيست. از جمله مشکلات پيش رو در کلونينگ ژن به وسيله‌ي پلاسميد 2µm حل مسئله‌ي نشانگر انتخابي است. چراکه وجود نشانگر انتخابي براي جداسازي ياخته‌هاي تراريخت از آنهايي که DNA نوترکيب را دريافت نکرده اند ضروري مي‌باشد.
معمولاً براي حل مشکل گزينش تراريخت‌ها از ميزبان‌هايي که در اثر جهش ژنتيکي توان ساخت يکي از آنزيم‌هاي دخيل در مسير متابوليسمي اسيدآمينه‌اي را از دست داده اند استفاده مي‌کنند. اين ميزبان را در اصطلاح «جهش يافته‌ي اگزوتروف» مي‌گويند چرا که براي ادامه‌ي حياتش لازم است که اسيدآمينه‌هايي که در مسير متابوليسمي آنها نقص ايجاد شده است به محيط کِشتش اضافه شود.
با وارد کردن ژن سالم آنزيمي که در ميزبان جهش يافته است به ناقل ژن مي‌توان تراريخت‌ها را غربال کرد. به اين ترتيب که با کشت سلول‌ها در «محيط کشت حداقل» (محيط فاقد هرگونه اسيدآمينه) تنها تراريخت‌ها، که از طريق DNA نوترکيب ژن سالم را دريافت کرده اند، قادر به ادامه‌ي حيات هستند و غير تراريخت‌ها نابود مي‌شوند.

در يونان باستان اجراي هنر نمايش يكي از سرگرمي هاي خاص بود و البته يكي از اين شخصيت هاي نمايش هاي  كمدي كه نماد مهمان ناخوانده را ايفا مي كرد جناب  انگل  بود كه نقش فردي مزاحم و آويزان را ايفا مي نمود كه بعد ها اين اصطلاح جهت تعريف نوع خاصي از روش زيست جانداران به كار برده شد.

تصوير فوق از كتاب :

تاريخچه گزارشات و كنترل بيماري هاي حيواني قابل انتقال به انسان (با بررسي و رويكرد تاريخي) اثر ژان بلانكو مي باشد كه تصويري از يك ماسك سفالي كشف شده از شهر ميرينا در يونان است كه در سال ۱۰۰ قبل از ميلاد ساخته شده است و جهت نماياندن شخصيت انگل به كار برده مي شده است .

روشهای الکتروفورز

پس ا ز استخراج مادة ژنتیک، مرحله بعدی تفکیک آن به قطعات تشکیل دهنده و شناسایی هر قطعه می باشد. همچنین در هنگام بررسی پروتئینهای سلولی نیز نیاز به تفکیک انواع پروتئینها از هم می باشد. به سبب اینکه ماکرومولکولهای زیستی باردار هستند می توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی ، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی ، وزن مولکولی و بار الکتریکی ، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می شود . روشهای مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است که در زیر به معرفی انواع متداول آن می پردازیم.

1)الکتروفورز سطحی : از یک نوار کاغذی یا استات سلولزی بعنوان فاز ثابت استفاده می شود. دو روش فوق جز در برخی کارهای پژوهشی کاربرد چندانی ندارند.

۲)الکتروفورز ژل : از یک محیط نیمه جامد (ژل ) بعنوان فاز ثابت استفاده میشود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می شود.
به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE ، به سبب اینکه پروتئینها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئینها شده و به آنها متصل می شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می نماید .

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر و اسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگتر از 500 جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته ای و قطعات DNA تک رشته ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه 100 جفت باز از آگاروز 3% و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگارز 8/. درصد استفاده می شود.در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل همزمان با الکتروفورز استفاده می شود. به این نوع ژلها، ژل واسرشت کننده می گویند. چنین ژل هائی پیچ و تابهای اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می شود. در این ژل ها مولکولهای کوچکتر در مقایسه با مولکول های بزرگتر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می کنند. از روش PAGE برای بررسی موتاسیون ها و تعیین توالی DNA استفاده می شود.

۳)الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار: چنانچه اشاره شد، هر چه غلظت ژل کمتر باشد با آن می توان مولکولهای بزرگتری را بوسیلة الکتروفورز ، تفکیک کرد. ولی در این رقت محدودیت وجود دارد به طوریکه حتی با رقیقترین ژلهای آگاروز هم نمی توان مولکولهای DNA بزرگتر از 100 کیلو جفت باز را تفکیک کرد. برای این منظور از روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار استفاده می شودکه دارای انواع مختلفی است:

آ)الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی (UPFGE ): یکی از ساده ترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار، روش UPFGE می باشد. برای این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود. در UPFGE ، میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و دوباره برقرار می شود. هنگامی که میدان برقرار است مولکول DNA بصورت گسترده در آمده و در جهت میدان حرکت می کند. با قطع شدن جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و DNA فرصت می یابد تا به حالت هیئت فضایی خاص خود در آید ولی با برقراری مجدد جریان حرکت مولکول آغاز می شود. در زمانی که میدان الکتریکی برقرار نیست همة مولکولها فرصت نمی کنند بطور کامل به شکل فضایی خود در آیند هر چه مولکول کوچکتر باشد سریعتر می تواند به شکل فضایی خود در آید و از آن خارج شود. براین اساس می توان مولکولهای نسبتاً بزرگ را از هم تفکیک کرد. با استفاده UPFGE می توان مولکولهایی تا اندازه 400 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. از این روش الکتروفورزی در انالیز ژن های بزرک نظیر ژن کد کننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، استفاده می شود.

ب)الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE) : در روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین ، معکوس می شود در این روش برای تفکیک مولکولهای کوچک از دامنه های زمانی کم استفاده می شود یعنی میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت .5/. ثانیه در جهت مستقیم و به مدت 25/. ثانیه در جهت مخالف برقرار می شود. در مورد مولکولهای بزرگتر از زمانهای بیشتر ، 3 ثانیه به جلوو 1 ثانیه در جهت مخالف استفاده می شود. با این روش می توان مولکولهایی تا اندازه 800 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد.

ج)ژل اکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار (PFGE:( PFGE یکی از متداولترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار است. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت بهم بصورت عمود قرار گرفته اند، در فواصل زمانی معین بطور متناوب استفاده می شود. یکی از این میدانها در جهت بالا به پائین و دیگری در جهت چپ به راست قرار دارد. مولکولهایDNA پس از آنکه تحت تأثیر میدان اول حرکت کردند در اثر میدان دوم 90 درجه تغییر جهت داده و حرکت می کنند. در اثر این روش مولکولهای DNA با یک حرکت چرخشی خود، در طول ژل بصورت زیگ زاگ حرکت می کنند. در روش PFGE می توان مولکولهای بسیار بزرگی در اندازه بین 20 هزار تا 2 میلیون جفت باز را از از هم تفکیک کرد.

تاریخچه ی الکتروفورز دو بعدی

الکتروفورز روشی است که در آن نمونه هایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ای متخلخل حرکت می کنند و از یکدیگر جدا می شوند. سیر تکوین وتکامل این روش در جداسازی پروتئینها ارتباط تنگاتنگی با تلاشهای انجام شده در بررسی پروتئینهای سرم دارد.

در سال۱۹۳۷، "Tiselius" روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئینهای سرم ابداع کرد. انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه ای " Zone Electrophoresis" مشهور شد، مشکلاتی بود که درحین بررسی پروتئینهای سرم وجود داشت. "Tiselius" برای اولین بار  فراکشن های آلفا ، بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گزاری کرد. وی به خاطر تحقیق بر روی الکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده ی پروتئینهای سرم را مشخص می کرد، جایزه ی نوبل شیمی را در سال ۱۹۴۸ از آن خود کرد.

نقطه ی عطف در توسعة الکتروفورز در دهه های ۴۰ و ۵۰ زمانی روی داد که علاوه بر الکتروفورز منطقه ای دو روش دیگر نیز ظهور کردند: ایزوالکتروفوکوسینگ ", IEFIsoelectrofocusing" و ایزوتاکوفورزیز " Isotachophoresis". بنابراین در آن زمان امکان انجام آنالیزهای جداسازی الکتروفورتیک سه گانه بر روی مخلوطهای پروتئینی یا بصورت جدا یا در ترکیب با همدیگر بوجود آمد.

اولین تجارب در جداسازی توسط الکتروفورز دوبعدی به کارهای Smithies  و Poulik در سال ۱۹۵۶ باز می گردد که با بکار بردنِ ترکیبی از الکتروفورز بر روی کاغذ و بر روی ژل نشاسته پروتئین های سرم را جداو تفکیک کردند.

پیشرفتهای بعدی در فناوری الکتروفورز، نظیر استفاده از پلی آکریل آمید و استفاده از شیبهای غلظتی پلی آکریل آمید، به سرعت در جداسازی های دو بعدی به کار گرفته شد. به خصوص استفاده از"IEF" در جداسازی دو بعدی این امر را امکان پذیر ساخت که جداسازی بُعد اول بر پایه خصوصیات بار الکتریکی پروتین ها صورت پذیرد. در سال ۱۹۷۰ الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید به همراه سدیم دو دسیل سولفات " Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE" توسط "Laemmli" معرفی شد.  ترکیب "IEF"  با "SDS-PAGE" در بُعد دوم منجر به ابداع روشی گشت که پروتئین ها را بر پایه دوعامل متفاوت یعنی بار الکتریکی و جرم مولکولی از یکدیگر جدا می ساخت. این روش برای انواع متفاوتی از نمونه ها با خواص حل پذیری متفاوت انطباق یافت؛ بدین معنی که استفاده از اوره و دترجنت های غیریونی در "IEF"، امکان محلول سازی نمونه های متفاوت را فراهم نمود. بدین ترتیب تا سال ۱۹۷۵ یک سیستم الکتروفورز دوبعدی تکامل یافت که می توانست برای آنالیز مخلوط های پروتئینی بدست آمده از کلِ یک سلول یا بافت ها بکار گرفته شود. براساس این پیشرفتها "O’Farrell" درسال ۱۹۷۵ روش الکتروفورز دوبعدی را که برای جداسازی پروتئینهای "E.coli" بهینه شده بود، گزارش کرد. او در این روش از ایزوالکتروفوکوسینگ در ژلهای پلی آکریل آمید  استوانه ای که حاوی ۸% اوره و ۲% "NP40"  بود، در ترکیب با"SDS-PAGE" ناپیوسته ی"Laemmli" استفاده کرد.

ترکیب جداسازی بر پایه بارالکتریکی (نقطه ایزوالکتریک یاpI) وجداسازی براساس اندازه (جرم مولکولی نسبی یا Mr ) باعث می شود که پروتئین های نمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزیع شوند. این شگرد اساس پیشرفت و تکامل الکتروفورز دوبعدی را در ۳۰ سال بعدی تشکیل داد به طوری که تا کنون هزاران مقاله با استفاده از آن انتشار یافته است.

مطالب ذیل یک سری نکات آموزنده در مورد تست های آماری است که از سایت دانشگاه ادینبورگ اقتباس کرده ام به آدرس ذیل که البته اگر به آن مراجعه کنید بهتر است چون در صفحه من یک کمی جداول به هم خورده: http://www.biology.ed.ac.uk/research/groups/jdeacon/statistics/tress9.html#Checklist: Chi-squared test for categories of data Background: The Student's t-test and Analysis of Variance are used to analyse measurement data which, in theory, are continuously variable. Between a measurement of, say, 1 mm and 2 mm there is a continuous range from 1.0001 to 1.9999 m m. But in some types of experiment we wish to record how many individuals fall into a particular category, such as blue eyes or brown eyes, motile or non-motile cells, etc. These counts, or enumeration data, are discontinuous (1, 2, 3 etc.) and must be treated differently from continuous data. Often the appropriate test is chi-squared (c2), which we use to test whether the number of individuals in different categories fit a null hypothesis (an expectation of some sort). Chi squared analysis is simple, and valuable for all sorts of things - not just Mendelian crosses! On this page we build from the simplest examples to more complex ones. When you have gone through the examples you should consult the checklist of procedures and potential pitfalls. A simple example Suppose that the ratio of male to female students in the Science Faculty is exactly 1:1, but in the Pharmacology Honours class over the past ten years there have been 80 females and 40 males. Is this a significant departure from expectation? We proceed as follows (but note that we are going to overlook a very important point that we shall deal with later). Set out a table as shown below, with the "observed" numbers and the "expected" numbers (i.e. our null hypothesis). Then subtract each "expected" value from the corresponding "observed" value (O-E) Square the "O-E" values, and divide each by the relevant "expected" value to give (O-E)2/E Add all the (O-E)2/E values and call the total "X2"   Female Male Total Observed numbers (O) 80 40 120 Expected numbers (E) 60*3 60*3 120 *1 O - E 20 -20 0 *2 (O-E)2 400 400   (O-E)2 / E 6.67 6.67 13.34 = X2 Notes: *1 This total must always be the same as the observed total *2 This total must always be zero *3 The null hypothesis was obvious here: we are told that there are equal numbers of males and females in the Science Faculty, so we might expect that there will be equal numbers of males and females in Pharmacology. So we divide our total number of Pharmacology students (120) in a 1:1 ratio to get our ‘expected’ values. Now we must compare our X2 value with a c2 (chi squared) value in a table of c2 with n-1 degrees of freedom (where n is the number of categories, i.e. 2 in our case - males and females). We have only one degree of freedom (n-1). From the c2 table, we find a "critical value of 3.84 for p = 0.05. If our calculated value of X2 exceeds the critical value of c2 then we have a significant difference from the expectation. In fact, our calculated X2 (13.34) exceeds even the tabulated c2 value (10.83) for p = 0.001. This shows an extreme departure from expectation. It is still possible that we could have got this result by chance - a probability of less than 1 in 1000. But we could be 99.9% confident that some factor leads to a "bias" towards females entering Pharmacology Honours. [Of course, the data don't tell us why this is so - it could be self-selection or any other reason] Now repeat this analysis, but knowing that 33.5% of all students in the Science Faculty are males   Female Male Total Observed numbers (O) 80 40 120 Expected numbers (E) 79.8*3 40.2 120*1 O - E 0.2 -0.2 0*2 (O-E)2 0.04 0.04   (O-E)2 / E 0.0005 0.001 0.0015 = X2 Note *1: We know that the expected total must be 120 (the same as the observed total), so we can calculate the expected numbers as 66.5% and 33.5% of this total. Note *2: This total must always be zero. Note *3: Although the observed values must be whole numbers, the expected values can be (and often need to be) decimals. Now, from a c2 table we see that our data do not depart from expectation (the null hypothesis). They agree remarkably well with it and might lead us to suspect that there was some design behind this! In most cases, though, we might get intermediate X2 values, which neither agree strongly nor disagree with expectation. Then we conclude that there is no reason to reject the null hypothesis. Some important points about chi-squared Chi squared is a mathematical distribution with properties that enable us to equate our calculated X2 values to c2 values. The details need not concern us, but we must take account of some limitations so that c2 can be used validly for statistical tests. (i) Yates correction for two categories of data (one degree of freedom) When there are only two categories (e.g. male/female) or, more correctly, when there is only one degree of freedom, the c2 test should not, strictly, be used. There have been various attempts to correct this deficiency, but the simplest is to apply Yates correction to our data. To do this, we simply subtract 0.5 from each calculated value of "O-E", ignoring the sign (plus or minus). In other words, an "O-E" value of +5 becomes +4.5, and an "O-E" value of -5 becomes -4.5. To signify that we are reducing the absolute value, ignoring the sign, we use vertical lines: |O-E|-0.5. Then we continue as usual but with these new (corrected) O-E values: we calculate (with the corrected values) (O-E)2, (O-E)2/E and then sum the (O-E)2/E values to get X2. Yates correction only applies when we have two categories (one degree of freedom). We ignored this point in our first analysis of student numbers (above). So here is the table again, using Yates correction:   Female Male Total Observed numbers (O) 80 40 120 Expected numbers (E) 60*3 60*3 120 *1 O - E 20 -20 0 *2 |O-E|-0.5 19.5 -19.5 0 (|O-E|-0.5)2 380.25 380.25   (|O-E|-0.5)2 / E 6.338 6.338 12.676 = X2 In this case, the observed numbers were so different from the expected 1:1 ratio that Yates correction made little difference - it only reduced the X2 value from 13.34 to 12.67. But there would be other cases where Yates correction would make the difference between acceptance or rejection of the null hypothesis. (ii) Limitations on numbers in "expected" categories Again to satisfy the mathematical assumptions underlying c2, the expected values should be relatively large. The following simple rules are applied: no expected category should be less than 1 (it does not matter what the observed values are) AND no more than one-fifth of expected categories should be less than 5. What can we do if our data do not meet these criteria? We can either collect larger samples so that we satisfy the criteria, or we can combine the data for the smaller "expected" categories until their combined expected value is 5 or more, then do a c2 test on the combined data. We will see an example below. Chi squared with three or more categories Suppose that we want to test the results of a Mendelian genetic cross. We start with 2 parents of genotype AABB and aabb (where A and a represent the dominant and recessive alleles of one gene, and B and b represent the dominant and recessive alleles of another gene). We know that all the F1 generation (first generation progeny of these parents) will have genotype AaBb and that their phenotype will display both dominant alleles (e.g. in fruit flies all the F1 generation will have red eyes rather than white eyes, and normal wings rather than stubby wings). This F1 generation will produce 4 types of gamete (AB, Ab, aB and ab), and when we self-cross the F1 generation we will end up with a variety of F2 genotypes (see the table below). Gametes Gametes   AB Ab aB ab AB AABB AABb AaBB AaBb Ab AABb AAbb AaBb Aabb aB AaBB AaBb aaBB aaBb ab AaBb Aabb aaBb aabb All these genotypes fall into 4 phenotypes, shown by colours in the table: double dominant, single dominant A, single dominant B and double recessive. We know that in classical Mendelian genetics the expected ratio of these phenotypes is 9:3:3:1 Suppose we got observed counts as follows   Phenotype     AB Ab aB ab Total Observed numbers (O) 40 20 16 4 80 Expected numbers (E) 45 15 15 5 80*1 O - E -5 5 1 -1 0 (O-E)2 25 25 1 1   (O-E)2 / E 0.56 1.67 0.07 0.20 2.50 = X2 [Note: *1. From our expected total 80 we can calculate our expected values for categories on the ratio 9:3:3:1.] From a c2 table with 3 df (we have four categories, so 3 df) at p = 0.05, we find that a c2 value of 7.82 is necessary to reject the null hypothesis (expectation of ratio 9:3:3:1). So our data are consistent with the expected ratio. Combining categories Look at the table above. We only just collected enough data to be able to test a 9:3:3:1 expected ratio. If we had only counted 70 (or 79) fruit flies then our lowest expected category would have been less than 1, and we could not have done the test as shown. We would break one of the "rules" for c2 - that no more than one-fifth of expected categories should be less than 5. We could still do the analysis, but only after combining the smaller categories and testing against a different expectation. Here is an illustration of this, assuming that we had used 70 fruit flies and obtained the following observed numbers of phenotypes.   Phenotype     AB Ab aB ab Combined aB + ab Total Observed numbers (O) 34 18 15 3 18 70 Expected numbers (E) 39.375 13.125 13.125 4.375 17.5 70*1 O - E -5.375 4.875     0.5 0 (O-E)2 28.891 23.766     0.25   (O-E)2 / E 0.734 1.811     0.014 2.559 = X2 One of our expected categories (ab) is less than 5 (shown in bold italics in the table). So we have combined this category with one of the others and then must analyse the results against an expected ratio of 9:3:4. The numbers in the expected categories were entered by dividing the total (70) in this ratio. Now, with 3 categories we have only 2 degrees of freedom. The rest of the analysis is done as usual, and we still have no reason to reject the null hypothesis. But it is a different null hypothesis: the expected ratio is 9:3:4 (double dominant: single dominant Ab: single dominant aB plus double recessive ab). Chi-squared: double classifications Suppose that we have a population of fungal spores which clearly fall into two size categories, large and small. We incubate these spores on agar and count the number of spores that germinate by producing a single outgrowth or multiple outgrowths. Spores counted: 120 large spores, of which 80 form multiple outgrowths and 40 produce single outgrowths 60 small spores, of which 18 form multiple outgrowths and 42 produce single outgrowths Is there a significant difference in the way that large and small spores germinate? Procedure: 1. Set out a table as follows   Large spores Small spores Total Multiple outgrowth 80 18 98 Single outgrowth 40 42 82 Total 120 60 180 2. Decide on the null hypothesis. In this case there is no "theory" that gives us an obvious null hypothesis. For example, we have no reason to suppose that 55% or 75% or any other percentage of large spores will produce multiple outgrowths. So the most sensible null hypothesis is that both the large and the small spores will behave similarly and that both types of spore will produce 50% multiple outgrowths and 50% single outgrowths. In other words, we will test against a 1:1:1:1 ratio. Then, if our data do not agree with this expectation we will have evidence that spore size affects the type of germination. 3. Calculate the expected frequencies, based on the null hypothesis. This step is complicated by the fact that we have different numbers of large and small spores, and different numbers of multiple versus single outgrowths. But we can find the expected frequencies (a, b, c and d) by using the grand total (180) and the column and row totals (see table below).     Large spores Small spores Row totals Multiple outgrowth Observed (O) 80 18 98   Expected (E) a b (expected 98) Single outgrowth Observed (O) 40 42 82   Expected (E) c d (expected 82)   Column totals 120 60 180 To find the expected value "a" we know that a total 98 spores had multiple outgrowths and that 120 of the total 180 spores were large. So a is 98(120/180) = 65.33. Similarly, to find b we know that 98 spores had multiple outgrowths and that 60 of the total 180 spores were small. So, b is 98(60/180) = 32.67. [Actually, we could have done this simply by subtracting a from the expected 98 row total - the expected total must always be the same as the observed total] To find c we know that a 82 spores had single outgrowths and that 120 of the total 180 spores were large. So c is 82(120/180) = 54.67. To find d we know that 82 spores had single outgrowths and that 60 of the total 180 spores were small. So d is 82(60/180) = 27.33. [This value also could have been obtained by subtraction] 4. Decide the number of degrees of freedom You might think that there are 3 degrees of freedom (because there are 4 categories). But there is actually one degree of freedom! The reason is that we lose one degree of freedom because we have 4 categories, and we lose a further 2 degrees of freedom because we used two pieces of information to construct our null hypothesis - we used a column total and a row total. Once we had used these we would have needed only one data entry in order to fill in the rest of the values (therefore we have one degree of freedom). Of course, with one degree of freedom we must use Yates correction (subtract 0.5 from each O-E value). 5. Run the analysis as usual. Calculating O-E, (O-E)2 and (O-E)2/E for each category, then sum the (O-E)2/E. values to obtain X2 and test this against c2 . The following table shows some of the working. The sum of the values shown in red gives X2 of 20.23     Large spores Small spores Row totals Multiple outgrowth Observed (O) 80 18 98   Expected (E) 65.33 32.67 98   O-E +14.67 -14.67   Yates correction |O-E|-0.5 +14.17 -14.17 0   (O-Ecorrected)2/E 3.07 6.14   Single outgrowth Observed (O) 40 42 82   Expected (E) 54.67 27.33 82   O-E -14.67 +14.67   Yates correction |O-E|-0.5 +14.17 -14.17 0   (O-Ecorrected)2/E 3.67 7.35 X2 = 20.23   Column totals 120 60 180 We compare the X2 value with a tabulated c2. with one degree of freedom. Our calculated X2 exceeds the tabulated c2 value (10.83) for p = 0.001. We conclude that there is a highly significant departure from the null hypothesis - we have very strong evidence that large spores and small spores show different germination behaviour. Checklist: procedures and potential pitfalls Chi squared is a very simple test to use. The only potentially difficult things about it are: calculating the expected frequencies when we have double classifications - use the marginal subtotals and totals to work out these frequencies determining the number of degrees of freedom, especially when we have to use some of the data to construct the null hypothesis. If you follow the examples given on this page you should not have too many difficulties. Some points to watch: Always work with "real numbers" in the observed categories, not with proportions. To illustrate this, consider a simple chi squared test on tossing of coins. Suppose that in 100 throws you get 70 "heads" and 30 "tails". Using Yates correction (for one degree of freedom) you would find an X2 value of 15.21, equating to a c2 probability less than 0.001. But if you got 7 "heads" and 3 "tails" in a test of 10 throws it would be entirely consistent with random chance. The ratio is the same (7:3), but the actual numbers determine the level of significance in a chi squared test. Observed categories must have whole numbers, but expected categories can have decimals. Follow the rules about the minimum numbers in expected categories. These rules do not apply to the observed categories. Remember Yates correction for one degree of freedom. CONTENTS INTRODUCTION THE SCIENTIFIC METHOD Experimental design Designing experiments with statistics in mind Common statistical terms Descriptive statistics: standard deviation, standard error, confidence intervals of mean. WHAT TEST DO I NEED? STATISTICAL TESTS: Student's t-test for comparing the means of two samples Paired-samples test. (like a t-test, but used when data can be paired) Analysis of variance for comparing means of three or more samples: For comparing separate treatments (One-way ANOVA) Calculating the Least Significant Difference between means Using a Multiple Range Test for comparing means For factorial combinations of treatments (Two-way ANOVA) Chi-squared test for categories of data Poisson distribution for count data Correlation coefficient and regression analysis for line fitting: linear regression logarithmic and sigmoid curves TRANSFORMATION of data: percentages, logarithms, probits and arcsin values STATISTICAL TABLES: t (Student's t-test) F, p = 0.05 (Analysis of Variance) F, p = 0.01 (Analysis of Variance) F, p = 0.001 (Analysis of Variance) c2 (chi squared) r (correlation coefficient) Q (Multiple Range test) Fmax (test for homogeneity of variance)

بدن جانداران از سلول های متنوعی تشکیل شده است و این تنوع باعث عملکرد اختصاصی تر این سلول ها شده است. بنابراین تمام سلول ها مجبور به انجام تمام عملکردهای فیزیولوژیک یا تولید تمام انواع محصولات لازم برای بقاء فرد نیستند. هر چند اغلب این سلول ها حاوی ارگانلهای داخلی مشترکی بوده و مسیرهای متابولیک مشترکی را طی می کنند، ولی هر سلولی اجزاء یا محصولات خاصی را بطور اختصاصی تر و به مقدار خیلی زیاد تر بیان می کند . در حقیقت بیان اختصاصی این جزء، موجب عملکرد اختصاصی سلول و متمایز شدن آن از سایر سلول ها می شود. بطوریکه سلول های مختلف، توانایی های مختلفی در انقباض یا انتقال پالس های الکتریکی یا ترشح محصول خاصی نظیر هورمون ها یا آنزیمها و غیره دارند. این تخصص در عملکرد سلول ها باعث می شود که حیوانات از انواع مختلفی از سلول ها تشکیل شوند. این سلول ها از نظر خصوصیاتی نظیر اندازه، شکل، ساختمان و عملکرد سلو لی با هم متفاوت هستند. به این نوع تفاوت سلولی تمایز 1 گفته می شود. در حقیقت این سلول ها از نظر ساختار ژنتیکی یکسان بوده ولی بیان ژنهای آنها تفاوت دارد ، بطوریکه مهره داران دارای بیش از 100 نوع سلول مختلف هستند که در اعضاء مختلف با عملکردهای مختلف دیده می شوند . بسیاری از سلول های حیوانات را می توان در خارج از بدن حیوان تکثیر داد. سلول های جدا شده از بافت ها و اعضای حیوانات می توانند در دمای مناسب در یک محیط حاوی مواد غذایی و عوامل رشد درون ظروف پلاستیکی رشد کنند. کشت اعضاء، بافت ها و سلول ها ی جانداران در محیط آزمایشگاهی را کشت سلولی 2 می نامند که کاربردهای متنوعی در شاخه های مختلف علوم زیستی دارد. بسیاری از سلول های جانداران در محیط خارج از بدن قابل کشت و نگهداری هستند . به عنوان مثال می توان به سلول های بافت همبند نظیر فیبروبلاستها؛ سلول های بافت اسکلتی نظیر سلول های استخوانی و غضروفی؛ سلول های بافت عضله قلب و عضله صاف؛ سلول ها ی اپی تلیال نظیر سلول های ریه، پستان، پوست، مثانه و کلیه؛ سلول های عصبی نظیر سلول های میکروگلیال؛ سلول های اندوکرین نظیر سلول های غده آدرنال، هیپوفیز و جزایر پانکراس ؛ ملانوسیتها و بسیاری از سلول های سرطانی اشاره کرد. در حقیقت توسعه تکنیک های کشت سلولی عمدتاً مدیون تحقیقات سرطان شناسی و ویروس شناسی می باشد.

اندازه گیری حیات، رشد و تکثیر سلولها کاربردهای مختلفی در تحقیقات دارد. یکی از قدیمی ترین روشها رنگ آمیزی سلولها با تریپان بلو است که حساسیت کافی نداشته و نیاز به بررسی میکروسکوپی دارد. روشهاي ديگري نظیر اندازه گيري ميزان كل اسيدهاي هسته اي و ميزان پروتئين در ليزات سلولي نیز از دقت كافي برخوردار نمي باشند.

اندازه گیری جذب مواد رادیواکتیو توسط سلولهای در حال رشد روش دقیقی است. تركيباتی نظیر تیمیدین نشاندار شده با تریتیوم و 5- برومودئواكسي اوريدين هنگام پروليفراسيون سلول وارد ساختمان هسته سلول شده و باعث نشاندار شدن سلولها می شوند. اما این روش نیز وقت گیر بوده و بعلاوه نیازمند هاروست کردن سلولها پس از تحریک سلولی است. همچنین مشکلات مربوط به کار با مواد رادیواکتیو نظیر دفع مواد باقی مانده و حفاظت از اشعه را نیز به دنبال دارد.

در سال 1983 آزمایش MTT بعنوان جایگزینی برای روش رادیواکتیو پیشنهاد شد. در این روش آنزیماتیک بعنوان سوبستراي واكنش از نمكهاي محلول تترازوليوم كه مهمترين آنها MTT است استفاده می شود. بوسیله این آزمایش ساده و دقیق می توان پاسخ سلولهای مختلف را به فاکتورهای خارجی از جمله فاکتورهای رشد، داروهای سایتوتوکسیک و سایر عوامل شیمیائی ارزیابی کرد. بطوریکه میزان فعالیت و سرعت تکثیر سلولها ممکن است تحت تاثیر هورمونها، فاکتورهای رشد، سايتوكينها و میتوژنها افزایش یافته یا تغییری نکند. همچنین تحت تاثیر بعضی از داروها و عوامل سایتوتوکسیک نظير داروهاي ضد سرطان ممکن است سلولها دچار نکروز یا آپپوپتوز شده و سرعت تکثیر یا رشدشان کاهش یابد.

این روش نسبت به ساير روشهاي بررسي پروليفراسيون سلولي ساده تر بوده و با امكانات موجود در اغلب آزمایشگاهها قابل اجراست. بعلاوه کلیه مراحل آزمایش در پلیتهای 96 خانه کشت سلولی انجام شده و نتایج با دستگاه الیزا ریدر قرائت می شود لذا تعداد زیادی نمونه را می توان همزمان آزمایش کرد.

اساس تست MTT :

آزمایش MTT که یک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شكسته شدن كريستالهاي زرد رنگ تترازوليوم با فورمول شيميائي3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) بوسيله آنزيم سوكسينات دهيدروژناز و تشكيل کریستالهای آبي رنگ نامحلول انجام می شود. در این روش برخلاف ساير روشها مراحل شستشو و هاروست كردن سلول كه اغلب باعث از دست رفتن تعدادي از سلولها می شوند حذف شده اند و تمام مراحل آزمايش از ابتداي كشت سلولي تا قرائت نتايج با فتومتر، در يك ميكروپليت انجام می شوند لذا تکرار پذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالا است. بطور کلی سلولها در محیط کشت به دو صورت چسبیده به پلیت (Attached) و شناور (suspended) دیده می شوند. در صورتی که آزمایش روی سلولهای چسبیده به پلیت نظیر سلولهای توموری و فیبروبلاستها انجام شود ابتدا بایستی تعداد مناسبی سلول (ترجیحا 5000 سلول در هر چاهک) را در هر یک از چاهکها کشت داده اجازه داد تا سلولها به کف پلیت چسبیده و بحالت پایدار خود درآیند. سپس چاهکهای کنترل و آزمایش انتخاب شده و مقدار مناسبی از ماده میتوژن یا داروی مورد نظر را به چاهکهای تست اضافه می کنیم و پلیت را تا زمان مورد نیاز جهت تاثیر ماده مورد نظر، انکوبه می کنیم. پس از اتمام زمان انکوباسیون محيط كشت روئي را دور ريخته به هر چاهك 200 ميكروليتر محيط كشت حاوي نيم ميليگرم در ميلي ليتر  محلول MTT اضافه نموده و به مدت 2 تا 4 ساعت در انكوباتورCO2  در 37 درجه سانتيگراد قرار می دهیم. در طی زمان انکوباسیون MTT توسط سيستم سوكسينات دهیدروژناز كه يكي از آنزيمهاي چرخه تنفسي ميتوكندريهاست احیا می شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستالهای آبی رنگ فورمازان می شود که در زیر میکروسکوپ براحتی قابل تشخیص هستند. ميزان رنگ توليد شده با تعداد سلولهايي كه از نظر متابوليك فعال هستند رابطه مستقيم دارد. کریستالهای فورمازان در آب غيرمحلول بوده و بايستي قبل از رنگ سنجی توسط ماده حلالي نظير DMSO بحالت محلول درآيند. در نهایت جذب نوری محلول بدست آمده را می توان در طول موج 570 نانومتر قرائت کرده و به کمک منحنی استاندارد تعداد سلولها را محاسبه نمود. برای هر رده سلولی ارتباط خطی بین تعداد سلولها و جذب نوری محلول نهائی وجود دارد لذا جهت بررسی هر نوع سلول بایستی منحنی استاندارد مربوط به همان رده را رسم نموده و استفاده کرد.

انجام آزمایش روی سلولهاي معلق یک اختلاف جزئی با سلولهای چسبیده دارد. در مورد سلولهای هیبریدوما تعداد 5000 سلول در هر چاهک برای آزمایش مناسب است. اما در مورد لنفوسیتهای انسانی ده برابر سلول بیشتری لازم داریم و معمولا بتعداد 25000 تا 250000 سلول در هر چاهک رنگ نهائی مناسبی می دهد.  در مورد سلولهای معلق باید پس از اتمام مراحل كار كشت سلولي پليت را در سانتريفيوژ مخصوص قرار داده و در دور 1000-2000 دور در دقيقه سانتريفيوژ نمود تا سلولهاي معلق در كف پليت رسوب كنند. در صورت لزوم می توان سلولها را با الكل يا فرمالدئيد در كف پليت فيكس نمود. عمل فيكساسيون بايستي در زمان كوتاهي انجام شود تا خصوصيات آنزيمي سلولها حفظ گردد. سپس سلولها را با PBS سرد شستشو داده و بر روي آنها محيط كشت حاوي MTT مي افزائيم. بقیه مراحل شبیه سلولهای چسبیده می باشد.

براي تهيه منحني استاندارد ابتدا يك سوسپانسيون سلولي با غلظت كاملاً مشخص مثلاً يك ميليون سلول در ميلي ليتر از سلولهاي مورد نظر تهيه كرده و پس از بررسي ويابيليتي آنها مقادير مشخص و فزاينده اي از آن را بصورت quadriuplicate در پليت 96 حفره اي كشت سلولي كشت مي دهيم. سپس اين پليت را به انكوباتور CO2 منتقل نموده و 24 ساعت بعد تست MTT انجام داده و با بدست آوردن مقادیر جذب نوری در مقابل تعداد سلول مربوطه منحني استاندارد را رسم می کنیم.

 REFERENCES

1.      Falak Reza ; (2001), M.S. Thesis. Tehran University, Iran.

2.      Khorramizadeh M. R. et al.; Iranian J. Allergy, Asthma & Immunol. 2004; 3, 1, 7-11.

3.      Khorramizadeh et al. (2002) Poster presen. 20th World Cong. of derm. PARIS.

4.      Mosmann T. (1983) J. Immunol. Methods 65, 55–63.

5.      Tada H. et al. (1986) J. Immunol. Methods 93, 157–165.

6.      Denizot F. et al. (1986) J. Immunol. Methods 89, 271–277.

7.      Gerlier, D. et al. (1986) J. Immunol. Methods 94, 57–63.

8.      Hansen, M. B. et al. (1989) J. Immunol. Methods 119, 203–210.

9.      Heeg K. et al.  (1985) J. Immunol. Methods 77, 237–246.

10.  Mosmann, T. et al. (1989) J. Immunol. Methods 116, 151–158.

11.  Ohno M. et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 199–203.

12.  Berg K. et al. (1988) J. Interferon Res. 8, (suppl. 1), S. 67.

13.  Green, L. M. et al. (1984) J. Immunol. Methods 70, 257–268.

14.  Espevik T. et al. (1986) J. Immunol. Methods 95, 99–105.

15.  Ferrari M. et al. (1990) J. Immunol. Methods 131, 165–172.

16.  Van de Loosdrecht et al. (1991) J. Immunol. Methods 141, 15–22.

17.  Berridge M. V. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303, 474-482.

18.  Altman F. P (1976) Prog. Histochem. Cytochem. 9(3):1-56.

19.  Kirkpatrick D. L. et al. (1990) Leukemia. Res. 14:459-466.

20.  Liu Y. B. et al. (1997); J. Neurochem. 69:581-593.

21.  Roehm N. W. et al. (1991)  J. Immunol. Methods 142:257-265.

22.  Sieuwerts A. M. et al. (1995)  Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 33:813-823.