روزگار ما و خاطرات ما

                يک روش کم هزينه ، سريع و تکرارپذير در مطالعه پروتئين ها است . اين روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی ، محاسبه مقدار نسبی و تعيين وزن مولکولی پروتئين ها و پپتيدها بکار می رود . درضمن با انجام روش بلاتينگ بعد از آن ، امکان بررسی آنتی ژنسيته يا تعيين توالی پروتئين ها و پلی پپتيدها فراهم می شود . اين روش را می توان به هدف خالص سازی مقادير کم پروتئين ها نيز بکار برد . بدين لحاظ امروزه SDS_PAGE به عنوان پُر استفاده ترين روش در ميان روش های الکتروفورزی مطرح است .

قابليت تفکيک کنندگی بسيار بالای روش SDS_PAGE عمدتاً ناشی از وجود سديم دودسيل سولفات (SDS) و ويژگی مناسب ژل پلی اکريل آميد در غربال پروتئين های مختلف است . SDS_PAGE با اتصال به پروتئين ها بار طبيعی آنها را می پوشاند و بار منفی با تراکم تقريباً مشابهی در اين مولکولها ظاهر می سازد . جداسازی پروتئين ها در اين شرايط وابسته به اندازه مولکولی و نتيجة اثر غربال کنندگی ژل پلی اکريل آميد است . زيرا با توجه به اندازة منافذ ژل حرکت پروتئين های کوچک تر با مزاحمت کمتر و حرکت پروتئين های بزرگتر با مزاحمت بيشتری همراه است . مسافت طی شده توسط پروتئينها در پايان الکتروفورز با وزن مولکولی آنها تناسب دارد . اين موضوع اساس تعيين وزن مولکولی در روش SDS_PAGE را تشکيل می دهد .

نقش سديم دودسيل سولفات

  سديم دودسيل سولفات (SDS) يک دترجنت آنيونی است ( شکل 1-3) که معمولاً به مناطق  آب گريز پروتئين ها متصل می شود. در SDS_PAGE برای آماده نمودن نمونه های پروتئينی ، آنها را در محلول حاوی مقدار کافی SDS_PAGE و ماده احيا کننده ( معمولاً 2ـ مرکاپتواتانول ) برای دقايقی در حرارت آب جوش قرار می دهند . در اين شرايط SDS رشته های پلی پپتيدی را اشباع می کند (4/1 گرم از آن به هر گرم پروتئين متصل می شود ) .

 دراثر اشباع شدن رشته های پروتئين با SDS ( در حضور حرارت و ماده احياکننده ):

 1ـ تفاوتهای بار طبيعی مولکولها پوشيده می شود و همه رشته های پلی پپتيدی بار منفی با تراکم تقريباً مشابهی پيدا می کنند.

2ـ پيوندهای دی سولفيدی آب گريز و هيدروژنی شکسته شده ، ساختار پروتئين کاملاً از هم باز می شود . لازم به ذکر است که پيوندهای پپتيدی در اين شرايط تغيير نمی کند و رشته های پلی پپتيدی ساختمان خطی خود را دارند .                   

3ـ واکنش های بين مولکولی حذف و پروتئين های آب گريز به راحتی محلول می شوند .                                     با توجه به توضيحات فوق ، پروتئين ها در SDS_PAGE همگی بار منفی با تراکم مشابهی پيدا نموده ، در دامنه وسيعی از PH به طرف آند حرکت می کنند . اگر اندازه منافذ ژل پلی اکريل آميد مناسب باشد،  ميزان حرکت پروتئين ها براساس اندازه مولکولی آنها خواهد بود . بدان معنا که هرچه اندازه مولکول بزرگتر باشد ، حرکت آن به دليل اصطکاک با محيط اطراف کمتر خواهد بود .

SDS معمولاً به قندها متصل نمی گردد . بدين خاطر پروتئين هايي که بخش قندی آنها بزرگ است ، SDS کمتری نسبت به وزن مولکولی به خود می گيرند . کاهش تراکم بار منفی در اين مواد باعث تحرک کمتر آنها در الکتروفورز می گردد و به اين دليل وزن مولکولی آنها بيش از حد طبيعی تخمين زده          می شود . برای حل اين مشکل می توان SDS_PAGE را در ژل های دارای شيب غلظت يا در سيستم بافری تريس ـ بورات ـ EDTA بجای بافر معمولی تريس ـ گليسين انجام داد . ظاهراً بورات با اتصال به قندها ، مولکول بار منفی بيشتری می دهد و کاهش اتصال SDS به اين مواد را جبران می کند .

اثر ژل  پلی اکريل آميد

 تفکيک پروتئين ها در SDS_PAGE ناشی از ويژگی مناسب ژل پلی اکريل آميد در غربال پروتئين ها با اندازه مولکولی متفاوت است . قطر منافذ پلی اکريل آميد که متأثر از غلظت دو جزء سازنده آن است           ( C%  و  T% ، ر.ش فصل 1 ) دامنه وزنی قابل تفکيک در SDS_PAGE را تعيين می نمايد . برای مثال در ژل با غلظت 5 ، 10 يا 15 درصد ( با فرض C معادل 6/2 درصد ) به ترتيب می توان پروتئين های در محدوده 300-200 ، 200-15 يا 100-12 کيلو دالتون را از هم تفکيک کرد . لازم به توضيح است که در هر درصد ژل ، رابطه مسافت طی شده و لگاريتم وزن مولکولی در محدوده کمی به صورت خطی است.  برای مثال در ژل با غلظت 5 ، 10 يا 15 درصد اين رابطه به ترتيب در محدوده وزنی 200-60 ، 70-16 يا 45-12 کيلو دالتون ( در سيستم بافری تريس ـ گليسين ) به صورت خطی است .

استفاده از ژل های دارای شيب غلظت در الکتروفورز دارای مزيت های چندی نسبت به ژل های با غلظت ثابت است . به اين دليل از اين نوع ژل ها هر روز استقبال بيشتری می شود . اين نوع ژل ها                  پروتئين های با اوزان متنوع تری را تفکيک می کند . برای مثال در ژل با شيب غلظت 30-3 درصد              ( و C معادل 6/2 درصد )پروتئين های با اوزان 500-10 کيلو دالتون قابل جداسازی هستند و مسافت طی شده با لگاريتم وزن مولکولی پروتئين ها در دامنه 210-12 کيلو دالتون به صورت خطی است . نازک بودن باندهای پروتئينی از ديگر مزيت های الکتروفورز در ژل های دارای شيب غلظت می باشد . زيرا اندازه منافذ در اين ژل ها به تدريج کوچک تر می گردد و ممانعت بيشتری برای جبهه جلويي هر باند نسبت به بخش عقبی آن وجود دارد . درضمن بسياری از گليکوپروتئين ها که دارای حرکت الکتروفورزی غيرطبيعی در ژل های با غلظت ثابت هستند ، در اين ژل ها رفتار طبيعی تری دارند .

SDS_PAGE در شرايط احيايي يا غيراحيايي

پيوندهای دی سولفيدی دورن يا بين زنجيره ای نقش عمده ای در شکل گيری ساختمان سوم و چهارم پروتئين ها دارند . احيای اين پيوندها توسط مواد تيول دار ( مثل 2ـ مرکاپتواتانول )منجر به قطع چنين اتصالاتی می شود . پروتئين های واجد پيوندهای دی سولفيدی هنگامی که در شرايط احيايي يا غيراحيايي الکتروفورز می شوند ، حرکت متفاوتی دارند . تجزيه اين پيوندها باعث جداشدن زيرواحدهای پروتئينی ( در پروتئين های چندواحدی ) و باز شدن زنجيره های پلی پپتيدی و درنتيجه امکان اتصال SDS به تمام ساختمان پروتئين می شود . بنابراين با الکتروفورز پروتئين در شرايط احيايي و غير احيايي می توان اطلاعاتی در مورد ساختمان آن بدست آورد . برای مثال آنتی بادی ها که از چهار زنجيره پلی پپتيدی ( دو زنجيره سنگين و دو زنجيره سبک ) تشکيل شده اند ، اگر در شرايط احيايي يا غيراحيايي الکتروفورز شوند ، الگوی الکتروفورزی متفاوتی از خود نشان می دهند ( شکل 2-3) .                             برای احيای پيوندهای دی سولفيدی معمولاً از 2ـ مرکاپتواتانول ( 2_ME )يا دی تيوتريتول (DTT ) استفاده می شود . برخلاف 2_ME ،  DTT بو ندارد ، به طور خودبه خود اکسيد نمی شود و دخالتی در نمونه های موجود در چاهک های کناری ندارد . بدين لحاظ با آن می توان يک نمونه را در شرايط احيايي و غيراحيايي در يک ژل و در چاهک های کنار هم الکتروفورز نمود .

سيستم بافری

SDS_PAGE را همچون ساير روش های الکتروفورز می توان در سيستم بافری پيوسته يا ناپيوسته انجام داد . همانگونه که قبلاً نيز توضيح داده شد ( ر.ش فصول 2 و 1 ) الکتروفورز در سيستم بافری ناپيوسته از نتيجه مطلوب تری برخوردار بوده ، متأثر از حجم نمونه نيست . از طرف ديگر اغلب پروتئين ها در حضور SDS ، واسرشته و به راحتی محلول می گردند ، درنتيجه SDS_PAGE به طور معمول در سيستم بافری ناپيوسته صورت می گيرد و انجام آن در سيستم بافری پيوسته به ندرت ديده می شود .

در SDS_PAGE مجموعه های پروتئين ـ SDS تراکم بار الکتريکی مشابهی دارند . بدين خاطر در ژل متراکم کننده با سرعت يکسانی حرکت می کنند و به صورت يک لايه بسيار نازک درمی آيند . با رسيدن اين مجموعه ها به ابتدای ژل جداکننده ، جداسازی آنها براساس اندازه مولکولی شروع می شود . درضمن بار خالص مجموعه های پروتئين ـ SDS در PH با دامنه 10-7 تغيير نمی کند و حرکت پروتئين ها در اين دامنه نيز تفاوت محسوسی ندارد .

بافر تريس ـ گليسين که در ابتدا توسط لاملی[1] ارائه شد ، پُراستفاده ترين سيستم بافری ناپيوسته در SDS_PAGE است . اين سيستم همان سيستم بافری است که قبلاً توسط دارويس و اورنشتاين برای الکتروفورز پروتئين ها در شرايط طبيعی ارائه شده بود ( ر.ش فصل 2 ) ، با اين تفاوت که SDS با غلظت 1/0 درصد نيز در آن وجود دارد . در بعضی موارد نشان داده اند که تغيير يا تعويض بافر تريس ـ گليسين با بافرهای ديگر عملاً به نتيجه مطلوب تری منتهی می شود . برای مثال پپتيدهای با وزن مولکولی کمتر از 12 کيلودالتون ، در سيستم بافری تريس ـ تريسين بهتر از بافر تريس ـ گليسين تفکيک می شوند . الکتروفورز پپتيدها در قسمت های بعدی اين فصل توضيح داده می شود . بافر تريس ـ بورات ـ EDTA از ديگر بافرهای ناپيوسته در  SDS_PAGE است که در مواردی برای جداسازی گليکوپروتئين ها بکار           می رود .

آماده سازی نمونه

 برای آماده سازی نمونه در SDS_PAGE بافر نمونه را با نسبت خاصی به آن افزوده ، سپس برای دقايقی در آب جوش يا درجه حرارت پايين تر قرار می دهند . در اين شرايط پروتئين ها به واسطه اثر SDS و ماده احياکننده ( در حالت الکتروفورز احيايي ) کاملاً واسرشته می شوند . مقدار SDS در بافر نمونه بايستی بارها بيش از مقدار پروتئين باشد ( حداقل 3 به 1 ) . زيرا درصورت اشباع نشدن پروتئين ها با SDS ، حرکت الکتروفورزی و وزن مولکولی آنها با هم تناسبی ندارد . بدين لحاظ رعايت نسبت وزن SDS به پروتئين ، بخصوص در محلول های با غلظت بالای پروتئين از اهميت ويژه ای برخوردار است . چنين وضعيتی درخصوص ماده احياکننده نيز صادق است .

وجود گليسرول يا ساکارز در بافر نمونه باعث سنگين شدن نمونه و قرارگرفتن آن در ته چاهک به هنگام نمونه گذاری می شود . اين موضوع بخصوص درحالتی که نمونه گذاری به دليل تعدد نمونه ها مدت زمان زيادی طول می کشد ، حائز اهميت است . درحالتی که الکتروفورز در حضور اوره صورت می گيرد ، افزودن گليسرول يا ساکارز به بافر نمونه ضرورتی ندارد . زيرا برای سنگين شدن نمونه وجود اوره کافی است.                                                                                                                                در SDS_PAGE معمولاً بعد از افزودن بافر نمونه به پروتئين و قبل از نمونه گذاری ، مخلوط آنها را دقايقی ( 15-2 دقيقه بسته به نوع پروتئين ) در آب جوش قرار می دهند . حرارت ، جداشدن زيرواحدهای پروتئين های چندواحدی و اشباع شدن زنجيره های پلی پپتيدی با SDS را تسهيل می کند  اين کار همچنين با غيرفعال کردن بسياری از پروتئازها ، امکان تجزيه پروتئين ها توسط اين آنزيم ها را از بين می برد . بسياری از پروتئين ها درصورتی که تحت تأثير حرارت قرار نگيرند ، حتی در حضور مقادير بسيار زياد SDS و ماده احياکننده نيز به طور کامل واسرشته نمی شوند . بنابراين در چنين حالتی حرکت الکتروفورزی متفاوتی از خود نشان می دهند . درمقابل ، حرارت در حرکت الکتروفورزی بعضی از پروتئين ها تأثيری ندارد . اين دسته از پروتئين ها بدون تأثير حرارت نيز با SDS اشباع می شوند و رفتار الکتروفورزی ثابتی دارند .

روش متداول SDS_PAGE پروتئين ها

با توجه به توضيحات کلی که در مورد SDS_PAGE پروتئين ها و شرايط تأثيرگذار بر آن داده شد ، اکنون می توان چگونگی انجام اين روش برای جداسازی پروتئين ها و پلی پپتيدها را توضيح داد . SDS_PAGE پروتئين ها که مبحث اين قسمت را تشکيل می دهد ، مبتنی بر روش لاملی با تغييرات اندکی می باشد . اين روش که معمولترين روش الکتروفورز در حضور SDS محسوب می شود ، کارايي بسيار بالايي در جداسازی پروتئن های با وزن مولکولی بيش از 15 کيلو دالتون دارد .

مواد

1- محلول استوک اکريل آميد (8/30 درصد ) .  30گرم اکريل آميد و 8/0 گرم بيس اکريل آميد را در زير هود وزن کنيد و در آب مقطر تا حجم نهايي 100 ميلی ليتر حل نماييد . محلول را با کاغذ واتمن شماره 1 صاف کنيد و در ظرف تيره بريزيد . اين محلول تا 3 ماه در يخچال قابل استفاده است.             

2- بافر ژل پايين . 2/18 گرم تريس باز و 4/0 گرم SDS را در حدود 70 ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد  PH محلول را با اسيد کلريدريک 2 مولار به 8/8 برسانيد . سپس آب مقطر تا حجم نهايي 100               ميلی ليتر اضافه کنيد . غلظت تريس در اين بافر 5/1 مولار است .

3- بافر ژل بالا . 1/6 گرم تريس باز و 4/0 گرم SDS را در حدود 50 ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد . با اسيد کلريدريک 2 مولار PH آن را به 8/6 برسانيد . سپس آب مقطر تا حجم نهايي 100 ميلی ليتر اضافه کنيد . غلظت تريس در اين بافر 5/0 مولار است .

4- بافر الکترود ( بافر مخازن ) . 3 گرم تريس باز ، 4/14 گرم گليسين و 1 گرم SDS را در يک ليتر آب مقطر حل کنيد . PH اين بافر حدود 3/8 است ( نيازی به تنظيم ندارد ) .

5- بافر نمونه (X 5 ). 10 ميلی ليتر بافر ژل بالا ، 5 ميلی ليتر گليسرول ، يک گرم SDS ، 5/0             ميلی ليتر محلول برموفنل بلو (1/0 درصد در اتانول ) و 1 ميلی ليتر 2ـ مرکاپتواتانول را در يک ظرف مخلوط کنيد . سپس با آب مقطر به حجم نهايي 20 ميلی ليتر برسانيد .

6- پرسولفات آمونيوم 10 درصد . 1/0 گرم پرسولفات آمونيوم در يک ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد (اين محلول بايستی تازه باشد).

7- TEMED 10 درصد . 1/0 ميلی ليتر TEMED در 9/0 ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد ( اين محلول بايستی تازه باشد ) .

8- استانداردهای وزن مولکولی .

روش آزمايش

1- صفحات شيشه ای را کاملاً تميز کنيد . بسته به ضخامت مورد نياز ژل ، فاصله اندازهای مربوط را بين صفحات شيشه ای قرار دهيد . قالب شيشه ای را با چند گيره محکم کرده ، به صورت عمودی روی يک سطح صاف قرار دهيد . درصورت احتمال نشت محلول ژل از حد فاصل شيَه ها و فاصله اندازها ، حدود 2/0 ميلی ليتر محلول آگارز داغ (5/0 درصد در آب مقطر ) در لبه اخلی قالب شيشه ای بگردانيد ( گرم کردن قالب شيشه ای باعث نفوذ بهتر آگارز در منافذ می شود ) .

2- محلول ژل پايين ( ژل جداکننده ) را از اجزای آن با توجه به درصد T تهيه کنيد ( نکته 8 ) . نحوه تهيه 12 ميلی ليتر محلول ژل پايين در درصدهای مختلف در جدول 1-3 آمده است . اجزای ژل پايين غير از TEMED را در يک ظرف مناسب مخلوط نماييد . محلول را در حدود 30 ثانيه با پمپ خلاء از هوا تخليه کنيد ( نکته 9 ) . سپس TEMED اضافه کرده ، پس از هم زدن به سرعت و دقت در قالب شيشه ای تا ارتفاع مناسب بريزيد ، به طوريکه حدود 3 سانتی متر فضا برای ژل بالا باقی بماند .  حدود 5/0 ميلی ليتر آب مقطر با سرنگ يا پاستور پی پت به آرامی از کناره شيشه روی سطح ژل بريزيد ، به نحوی که با ژل مخلوط نگردد ( نکته 10 ) . انعقاد ژل پايين معمولاً 45-15 دقيقه طول می کشد . ژل منعقد شده به وضوح از آب مقطر روی آن ( به دليل تفاوت در ضريب شکست نور ) قابل تشخيص است.           

3- بعد از انعقاد ژل پايين ، محلول ژل بالا ( ژل متراکم کننده ) را طبق تهيه کنيد . غلظت اين ژل معمولاً 3، 4 يا 5 درصد است . اجزای ژل بالا غير از TEMED را در ظرف مناسبی مخلوط کنيد. آب روی ژل پايين را کاملاً تخليه نماييد و برای حذف قطرات باقيمانده آب ، حدود 1 ميلی ليتر محلول ژل بالا را در جدار داخلی شيشه بگردانيد و مجدداً تخليه نماييد . به بقيه محلول ژل بالا TEMED اضافه کنيد و پس از هم زدن سريعاً تا ارتفاع مناسب روی ژل پايين بريزيد. سپس شانه را در ژل بالا فرو ببريد ، به طوريکه دندانه های آن حدود 5/1 سانتی متر از سطح ژل پايين فاصله داشته باشد . ژل بالا معمولاً در کمتر از 15 دقيقه منعقد می شود . بهتر است قبل از درآوردن شانه ، انتهای دندانه های آن را روی شيشه با ماژيک مشخص نماييد . اين موضوع به تشخيص چاهک ها و تصهيل در نمونه گذاری کمک می کند ( نکته 11 ) .

4- شانه و فاصله انداز پايين را از حد فاصل شيشه ها خارج کنيد . هرگونه ژل اضافی يا محلول منعقد نشده درون چاهک ها يا انتهای ژل را با تزريق بافر الکترود خارج سازيد . قالب شيشه ای را با چند گيره به تانک الکتروفورز متصل نموده ، مخازن را تا ارتفاع مناسب با بافر الکترود پر کنيد .هرگونه حباب هوا در انتهای ژل را با تزريق بافر توسط سرنگ خارج نماييد .

5- يک حجم بافر نمونه (X5 ) را به 4 حجم نمونه پروتئين اضافه نماييد ( برای مثال 20 ميکروليتر بافر و 80 ميکروليتر نمونه ) . اگر پروتئين به صورت پودر است ، مقدار مورد نياز آن را در بافر نمونه که 5 بار با آب مقطر رقيق شده ( بافر X1)حل کنيد . نمونه و بافر نمونه را در يک ظرف کوچک درب دار ريخته ، 10-3 دقيقه ( معمولاً 5 دقيقه ) در ظرف آب جوش قرار دهيد . درصورت کدورت نمونه و يا وجود ذرات نامحلول ، آن را به مدت 10 دقيقه در g   10000 سانتريفيوژ کنيد . سپس با سرنگ هاميلتون يا سمپلر مناسب 30-10 ميکروليتر از هر نمونه را به دقت در چاهک ها بريزيد . به دليل وجود گليسرول ، نمونه در ته چاهک قرار می گيرد . مقدار پروتئين لازم در هر چاهک بستگی به ميزان خلوص نمونه و روش رنگ آميزی دارد ( نکته 12 ) .

6- کابل ها را به الکترودهای مربوطه وصل نماييد. برای الکتروفورز در جريان الکتريکی ثابت ، شدت جريان 30-20 ميلی آمپر مناسب است ( نکته 13 ) . در اين حالت رنگ نشانگر (برموفنل بلو ) در عرض 5/2-5/1 ساعت به انتهای ژل می رسد . اگر احتمال حرکت مهادل يا سريع تر بعضی از اجزای نمونه نسبت به رنگ نشانگر وجود دارد ، جريان برق را قبل از رسيدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع کنيد .

7- بعد از قطع جريان برق ، قالب شيشه ای را از تانک الکتروفورز جدا کنيد و آن را در کف دست          ( با دستکش ) قرار دهيد . با فروبردن يک قاشقک فلزی نازک به حد فاصل شيشه ها و چرخاندن آرام آن  شيشه بالا را جدا کنيد . ژل متراکم کننده را با لبه يکی از فاصله اندازها قطع کنيد و دور بياندازيد (نکته 14 ). ژل را رنگ آميزی نماييد .

نکات 1-14

1- در  آب مقطر T% و C% به ترتيب 8/30 و 6/2 درصد است . با رقيق کردن آن درصد T کم می شود ولی درصد C تغيير نمی کند . برای تهيه ژل با درصد C متفاوت بايستی نسبت اکريل آميد و بيس اکريل آميد را در هنگام تهيه محلول استوک تغيير داد.

2- اين بافر اصطلاحاً X4  است . درهنگام تهيه ژل يک حجم از آن با سه حجم از بقيه اجزای سازنده ژل مخلوط می گردد .

3- اين بافر تا چندين ماه در يخچال قابل استفاده است .

4- می توان از دی تيو تريتول (DTT ) به جای 2ـ مرکاپتواتانول به عنوان ماده  احياکننده در بافر نمونه استفاده کرد . غلظت 5/0 ـ3/0 مولار DTT در بافر نمونه (X5) کافی است .

5- بافر نمونه چندين هفته در يخچال و ماه ها در دمای 20ـ درجه سانتيگراد قابل استفاده است . بهتر است اين بافر را در حجم های کم در ظروف تميز تقسيم و در دمای 20 ـ درجه سانتيگراد نگهداری کنيد

6- در حالتی که SDS_PAGE در شرايط غيراحيايي صورت می گيرد ، ماده ی احيا کننده به بافر نمونه افزوده نمی شود .

7- انتخاب نوع استاندارد بستگی به فرزند مولکولی پروتئين های مورد مطالعه و وضعيت غلظت ژل                ( دارای درصد ثابت يا شيب غلظت ) دارد . در ژل با غلظت ثابت معمولاً از استاندارد  با وزن مولکولی پايين (LMW)[2] يا بالا (HMW )[3] استفاده می شود .

8- برای تهيه حجم v از ژل با درصد T مورد نظر ، حجم V_S  را طبق فرمول زير محاسبه و از محلول استوک برمی داريم و با  از بافر ژل و آب مقطر به ميزان  مخلوط می کنيم .

T_S  در اين آزمايش معادل 8/30 درصد است . در اين روابط حجم پرسولفات آمونيوم و TEMED درنظر گرفته نشده اند ، زيرا حجم آنها قابل توجه نيست .

9- اکسيژن از پليمريزاسيون اکريل آميد جلوگيری می کند . درضمن پليمريزاسيون يک واکنش گرمازا است که می تواند به خروج مولکول های گاز و تشکيل حباب های هوا ( بخصوص در ژل های غليظ ) منجر می شود . بدين لحاظ تخليه هوا در ژل های با غلظت بيش از 10 درصد ضروری تر است .

10- اين کار به منظور صاف شدن سطح ژل و جلوگيری از تماس هوا با آن است . برای اين کار از ايزوپروپانول اشباع با آب نيز می توان استفاده کرد . با اين وجود ، آب مقطر کفايت می کند . در صورت تجربه کافی می توان محلولهای ژل پايين و بالا را باهم تهيه نمود و پس از ريختن محلول ژل پايين ، سريعاً محلول ژل بالا را به دقت اضافه کرد . در اين حالت هر دو محلول ژل يکباره به درون قالب شيشه ريخته می شود و به آب مقطر نيازی نيست .

11- اگر موقعيت چاهک ها مشخص نباشد ، ممکن است نمونه گذاری به طور صحيح صورت نگيرد يا ته چاهک ها در اثر فرو رفتن نوک وسيله نمونه گذار دچار آسيب گردد. راه ديگر تشخيص چاهک ها ، افزودن يک قطره محلول بروموفنل بلو به محلول ژل بالا در هنگام تهيه آن است . در اين حالت ژل بالا به رنگ آبی روشن درمی آید .

12- اگر محلول پروتئينی خالص يا حاوی 3-2 نوع پروتئين باشد ، حدود 10 ميکروگرم ( در رنگ آميزی کوماسی آبی ) يا حداکثر 5/0 ميکروگرم ( در رنگ آميزی نقره ) از آن در هر چاهک کافی است . درصورتی که محلول پروتئينی عصاره سلول يا بافت ( حاوی ده ها نوع پروتئين ) باشد ، 100-50 ميکروگرم ( در رنگ آميزی کوماسی آبی ) يا 10-1 ميکروگرم ( در رنگ آميزی نقره ) از آن در هر چاهک کافی است.

13- در اين حالت ، ولتاژ در طی آزمايش بالا رفته و گرمای بيشتری توليد می گردد (ر.ش فصل 1).           در چنين شرايطی بهتر است دستگاه الکتروفورز با گردش آب ( با دمای 20-15 درجه سانتيگراد ) خنک گردد . درصورت فقدان سيستم خنک کننده می تواند الکتروفورز  را در ولتاژ ثابت انجام داد . ولتاژ     150-100 ولت در اين مورد کافی است . می توان الکتروفورز را با ولتاژ پايين ( برای مثال 30 ولت ) در طول شب نيز انجام داد . البته در اين خصوص لازم است شرايط مناسب تجربه شود .

14- درصورتی که پروتئينی در ژل بالا يا ابتدای ژل پايين مانده باشد ، بهتر است ژل بالا جدا نشود و همراه بقيه ژل رنگ آميزی گردد.

SDS_PAGE در شيب غلظت اکريل آميد

در اين نوع الکتروفورز غلظت اکريل آميد به تدريج به طرف انتهای ژل ( بطرف آند ) زيادتر و در نتيجه اندازه منافذ آن کوچک تر می شود . الکتروفورز در ژل با غلظت ثابت دارای چندين مزيت است. ژل های دارای شيب غلظت قادرند پروتئين های متنوع تری از نظر وزن مولکولی را تفکيک کنند . بدين لحاظ رابطه مسافت طی شده با وزن مولکولی در دامنه وسيع تری به صورت خطی است . درضمن در اين              ژل ها امکان تفکيک پروتئين های با اوزان مولکولی نزديک به هم بيشتر است . به دليل کوچک تر شدن منافذ در ژل های دارای شيب غلظت ، حرکت جبهه جلويي هر باند پروتئينی با مزاحمت بيشتری نسبت به جبهه عقبی آن همراه است . اين موضوع به نازک شدن باندهای پروتئينی در طول الکتروفورز  و امکان تفکيک بهتر آنها منتهی می شود .

اصول انجام SDS_PAGE در ژل دارای شيب غلظت مشابه انجام اين روش در ژل با غلظت ثابت بوده ، تنها تفاوت آنها در نحوه آماده سازی ژل است . بدين لحاظ فقط به توضيح اين مرحله از کار اکتفا می شود . از نظر عملی شيب غلظت اکريل آميد در دامنه 30-3 درصد قابل تهيه است . با اين حال انتخاب محدوده اين شيب متأثر از محدوده وزنی مخلوط پروتئينی مورد مطالعه و يا اجزای مورد نظر در اين مخلوط می باشد .

برای تهيه ژل دارای شيب غلظت ابتدا بايستی دو محلول با غلظت های مختلف اکريل آميد آماده کرد .

سپس با استفاده از ظروف مرتبط ( شيب ساز ) ، يکی از اين دو محلول به تدريج در ديگری حل و توسط پمپ پريستالتيک يا نيروی ثقل وارد قالب شيشه می گردد . ظروف مرتبط را در آزمايشگاه نيز می توان ساخت . برای تهيه شيب خطی غلظت بايستی سطح مقطع دو ظرف معادل همديگر باشد . اگر سطح مقطع ظروف متفاوت انتخاب گردد ، امکان تهيه ژل دارای شيب غلظت مقعر يا محدب نيز وجود دارد . روش ديگری نیز برای تهيه شيب غلظت که نيازمند پمپ پريستالتيک دو کاناله است ، وجود دارد .

وجود گليسرول در محلول ژل غليظ ، برای حفظ شيب ژل و جلوگيری از مخلوط شدن لايه های آن مخصوصاً در هنگام پليمريزاسيون که با توليد گرما همراه است ، مهم می باشد . از آنجايي که پليمريزاسيون ژل از لايه های رقيق تر شروع می شود و اين موضوع می تواند با ايجاد جريان گرمايي باعث برهم خوردن شيب غلظت گردد . می تواند پرسولفات آمونيوم و TEMED را در محلول رقيق کاهش داد .

SDS_PAGE پپتيدها

پلی پپتيدهای کوچک تر از 12 کيلو دالتون با روش معمول SDS_PAGE در سيستم بافری تريس ـ گليسين حتی در ژل های با غلظت بالا نيز به طور مطلوب تفکيک نمی شوند . زيرا اين مولکولها در اتصال با SDS ، کمپلکس های هم اندازه ای تشکيل می دهند . اسمونک[4] و مونکوس[5] نشان دادند که اگر SDS_PAGE در سيستم بافری تريس ـ فسفات با 8/6 PH در حضور غلظت 8 مولار اوره صورت گيرد و نسبت بيس اکريل آميد به اکريل آميد در ژل افزايش يابد ( C معادل 10 درصد ) ، جداسازی پلی پپتيدهای کوچک بهتر صورت می گيرد . در چنين شرايطی ، مسافت طی شده با وزن مولکولی پلی پپتيدها در دامنه 20- 5/2 کيلو دالتون دارای رابطه خطی است .

برای حل مشکل فوق اسکاگر[6] و فون جاگو[7] روش ديگری ارائه کردند که در ان نيازی به غلظت  بالای اوره نبود . آنها به جای گليسين ، از تريسين[8] در بافر الکترود استفاده نمودند ( سيستم بافری تريس ـ تريسين ). تريسين به دليل حرکت الکتروفورزی سريع تر نسبت به گليسين باعث می شود تا                کمپلکس های پپتيد ـ SDS بهتر تفکيک گردند . درضمن اين ماده برخلاف گليسين در آزمايشاتی همچون تعيين توالی اسيدهای آمينه اختلال ايجاد نمی کند .

روشی که در اين قسمت برای  جداسازی پپتيدها توضيح داده می شود ، شکل تغييريافته ای از روش اسکاگر و فون جاگو است که در آن ژل شامل سه بخش پايين ( ژل جداکننده ) ، ميانی ( ژل وسط)[9] و بالا ( ژل متراکم کننده ) است . اين بخش ها دارای درصدC  مشابه و درصد T متفاوت هستند . در اين روش پلی پپتيدهايي که در دامنه وزنی 40-1 کيلو دالتون قرار دارند ، به نحو مطلوبی تفکيک می گردند  

مواد

1- محلول استوک اکريل آميد . 1/29 گرم اکريل آميد و 9/0 گرم بيس اکريل آميد در زير هود وزن کرده ، در آب مقطر تا حجم نهايي 100 ميلی ليتر حل نماييد . محلول را صاف و در ظرف تيره يخچال نگهداری کنيد . T و C در اين محلول به ترتيب 30 و 3 درصد است .

2- بافر ژل پايين و ميانی . 4/36 گرم تريس باز و 3/0 گرم SDS را در حدود 80 ميلی ليتر آب مقطر حل کرده ، PH آن را با اسيد کلريدريک غليظ ( 3 مولار يا بالاتر ) به 9/8 برسانيد . سپس آب مقطر تا حجم نهايي 100 ميلی ليتر اضافه نماييد . غلظت تريس در اين بافر 3 مولار است.

3- بافر ژل بالا . 6 گرم تريس باز را در حدود 50 ميلی ليتر آب مقطر حل کرده ، PH آن را با اسيدکلريدريک 2 مولار به 8/6 برسانيد . سپس آب مقطر تا حجم نهايي 100 ميلی ليتر اضافه نماييد . غلظت تريس در اين بافر 5/0 مولار است .

4- بافر کاتد ( مخزن بالا) . 1/12 گرم تريس باز ، 9/17 گرم تريسين و 1 گرم SDS را در يک ليتر اب مقطر حل کنيد . PH اين محلول حدود 2/8 است و نيازی به تنظيم ندارد . غلظت تريس ، تريسين و SDS در اين بافر به ترتيب 1/0 مولار ، 1/0 مولار  و 1/0 درصد (W⁄V) است .

5- بافر آند ( مخزن پايين ) . 2/24 گرم تريس باز را در حدود نيم ليتر آب مقطر حل کرده ، PH آن را با اسيد کلريدريک ( 1 يا 2 مولار ) به 9/8 برسانيد . سپس آب مقطر تا حجم نهايي يک ليتر اضافه کنيد . غلظت تريس در اين بافر 2/0 مولار است .

6- بافر نمونه ( X2). شامل 2/0 گرم SDS ، 25/1 ميلی ليتر بافر ژل بالا ، 1 ميلی ليتر گليسرول و 5/7 ميلی ليتر آب مقطر است . پس از مخلوط کردن اجزای فوق چند کريستال برموفنل بلو اضافه کنيد تا محلول آبی رنگ گردد.

7- محلول EDTA 2/0 مولار . 152/0 گرم EDTA ( نمک دارای چهار سديم ) را در 2 ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد .

8- محلول پرسولفات آمونيوم 10 درصد . 1/0 گرم پرسولفات آمونيوم در 1 ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد ( اين محلول بايستی تازه باشد ).

9- محلول TEMED 10 درصد . 1/0 ميلی ليتر TEMED در 9/0 ميلی ليتر آب مقطر حل کنيد ( اين محلول بايستی تازه باشد ) .

10- استانداردهای وزن مولکولی مربوط به پپتيدها .

روش آزمايش

همان گونه که در صفحات پيشين توضيح داده شد ، ژل مورد استفاده برای جداسازی پپتيدها از سه قسمت پايين (جداکننده) ، ميانی ( وسطی ) و بالايي ( متراکم کننده ) تشکيل می شود . درصد C در اين سه قسمت ثابت (3 درصد ) است ، درحاليکه درصد T به ترتيب از پايين به بالا شامل 5/16 ، 10 و 4 درصد می باشد . از کل ارتفاع ژل ، حدود 2 سانتی متر به ژل بالا ، حدود 5/1 سانتی متر به ژل ميانی و بقيه آن به ژل پايين اختصاص دارد . آماده سازی ژل و الکتروفورز طبق مراحل زير انجام می گيرد .

1- قالب شيشه ای را مطابق روش های قبلی آماده نموده ، با ماژيک ارتفاع هريک از سه قسمت ژل را روی شيشه جلويي مشخص کنيد . اجزای ژل پايين غير از TEMED را در ظرف تميزی مخلوط نماييد . پس از هواگيری ، TEMED اضافه کنيد و محلول ژل را در قالب شيشه ای تا ارتفاع مشخص شده بريزيد . حدود نيم ميلی ليتر آب مقطر با سرنگ يا پاستور پی پت به آرامی از کناره شيشه روی سطح ژل بريزيد ، به نحوی که با ژل مخلوط نگردد. انعقاد ژل 45-15 دقيقه طول می کشد . ژل منعقد شده به دليل ضريب شکست متفاوت ، از آب مقطر قابل تشخيص است .

2- اجزای ژل ميانی غير از TEMED را در ظرف تميزی مخلوط نماييد . آب روی ژل پايين را کاملاً تخليه کنيد و برای حذف قطرات باقيمانده آب ، حدود 1 ميلی ليتر محلول ژل ميانی را در جدار داخلی شيشه بگردانيد و مجدداً تخليه نماييد . به بقيه محلول ژل ميانی TEMED اضافه نموده ، پس از هم زدن ، سريعاً تا ارتفاع مربوطه روی ژل پايين اضافه کنيد . مطابق مرحله قبل حدود نيم ميلی ليتر آب مقطر روی سطح ژل بريزيد .

3- پس از انعقاد ژل ميانی ،اجزای ژل بالا غير از TEMED را در ظرفی مخلوط نماييد . آب سطح ژل را کاملاً تخليه کنيد و مطابق مرحله قبل با حدود يک ميلی ليتر محلول ژل بالا ، قطرات باقيمانده آب را خارج سازيد . به بقيه محلول ژل بالا TEMED اضافه کرده ، پس از هم زدن ، به سرعت تا ارتفاع مناسب روی ژل ميانی بريزيد . سپس شانه را در ژل بالا فرو ببريد ، به طوری که دندانه های آن حدود يک سانتی متر از سطح ژل ميانی فاصله داشته باشد . موقعيت انتهای دندانه های شانه را با ماژيک روی شيشه علامت گذاری نماييد .

4- پس از انعقاد ژل بالا ، شانه و فاصله انداز پايين را از قالب شيشه ای خارج سازيد . هرگونه ژل اضافی يا محلول منعقد نشده را با تزريق بافر الکترود به درون چاهک ها خارج کنيد . قالب شيشه ای را با کمک گيره ها به تانک الکتروفورز ملحق نماييد . ابتدا مخزن بالا را تا ارتفاع مناسب با بافر کاتد پر کنيد . در صورت عدم نشت بافر اين مخزن ، بافر آند را به مخزن پايين اضافه نماييد . هرگونه حباب هوا در انتهای ژل را با تزريق بافر آند خارج سازيد .

5- يک حجم بافر نمونه و يک حجم نمونه يا محلول استاندارد را در ظرف کوچک درب دار مخلوط کرده ، 20-10 دقيقه در ظرف آب جوش قرار دهيد . سپس با سرنگ هاميلتون يا سمپلر مناسب 30-5 ميکروليتر از هر نمونه را به دقت در چاهک ها بريزيد ( نکته 1) .

6- کابل ها را به الکترودهای مربوطه وصل کنيد . برای الکتروفورز در جريان الکتريکی ثابت ، شدت جريان 50-40 ميلی آمپر مناسب است . در صورت فقدان سيستم خنک کننده و داغ شدن بيش از حد معمول شيشه ها می توانيد در شدت جريان پايين تر ، ولتاژ يا توان ثابت کار کنيد ( نکته 2) .

7- بعد از رسيدن رنگ نشانگر به انتهای ژل ، جريان برق را قطع کنيد . قالب شيشه ای را از تانک الکتروفورز جدا کنيد و آن را در کف دست ( با دستکش ) قرار دهيد . شيشه بالا را برداريد . ژل بالا را با کمک يکی از فاصله اندازها قطع کرده ، دور بياندازيد . بسته به هدف آزمايش می توان ژل را رنگ آميزی نمود يا باندهای پپتيدی را به غشا انتقال داد .

نکات 2-1

1- مقدار مورد نياز نمونه در هر چاهک بستگی به خلوص آن و هدف آزمايش دارد . اگر هدف از آزمايش تعيين توالی اسيد آمينه های يک پپتيد يا پپتيدهاي خاصی باشد ، مقدار نمونه بايستی تا حد امکان زياد باشد . برای رنگ آميزی با کوماسی آبی مقدار يک ميکروگرم از هر پپتيد کافی است مقدار مورد نياز در رنگ آميزی به روش نقره ده ها بار کمتر از روش رنگ آميزی با کوماسی آبی است .

2- الکتروفورز در شدت جريان ثابت در سيستم بافری ناپيوسته به تديج با افزايش ولتاژ و گرما همراه است. بدين لحاظ در صورت فقدان سيستم خنک کننده می توان آزمايش را در ولتاژ ثابت ( حدود 100- 80 ولت ) يا توان ثابت (7-5 وات ) انجام داد . به هرحال انتخاب شرايط مطلوب در هر مورد تا حدود زيادی تجربی است .

تعيين وزن مولکولی

همان گونه که قبلاً ذکر شد ، سديم دودسيل سولفات در حضور ماده احياکننده و حرارت به سرتاسر زنجيره های پلی پپتيدی وصل می شود . مقدار SDS که به هر زنجيره پلی پپتيدی متصل می گردد ، متناسب با وزن مولکولی (M_r ) آن است . مجموعه های پلی پپتيد ـ SDS حاصله که تراکم بار الکتريکی مشابهی دارند ، در ژل پلی اکريل آميد براساس وزن مولکولی خود حرکت می کنند . تحت چنين شرايطی مسافت نسبی طی شده توسط پروتئين ها با لگاريتم وزن مولکولی آنها رابطة خطی دارد . بنابراين اگر چند پروتئين شناخته شده به عنوان استانداردهای وزنی[10]  در دسترس باشد ، می توان وزن مولکولی پروتئين های مورد مطالعه را براساس انها تخمين زد .

روش

1- استانداردهای وزنی و نمونه های مورد مطالعه را در شرايط يکسان الکتروفورز نماييد . استانداردها و نمونه ها را می توان در يک چاهک يا چاهک های جداگانه قرار داد . پس از اتمام SDS_PAGE ، ژل را رنگ آميزی نماييد. ( روش های رنگ آميزی در فصل 6 توضيح داده شده اند ) .

2- فاصله رنگ نشانگر ( برمو فنل بلو ) و باندهای پروتئينی (لبه جلويي هر باند ) را از ابتدای ژل جداکننده اندازه گيری نموده ، سپس حرکت نسبی ( R_f )[11] هر پروتئين را طبق رابطه زير محاسبه کنيد . R_f  را می توان از روی تصوير ژل نيز تعيين کرد .

3- باتوجه به اطلاعات مربوط به اوزان مولکولی و  پروتئين های استاندارد ، منحنی استاندارد را روی کاغذ نيمه لگاريتمی رسم نماييد . محور لگاريتمی کاغذ به اوزان مولکولی اختصاص دارد . وزن مولکولی پروتئين های مورد مطالعه را از روی منحنی استاندارد محاسبه نماييد .

       در حال حاضر انواعی از استانداردهای وزنی توسط شرکت های مختلف عرضه می شود . بعضی از اين استانداردها رنگی بوده ، بدون رنگ آميزی قابل تشخيص هستند . انتخاب نوع استاندارد بايستی باتوجه به محدوده وزنی پروتئين های مورد مطالعه و غلظت ژل پلی اکريل آميد ( غلظت ثابت يا شيب غلظت ) صورت گيرد . قابل توجه است که در هر ژل با غلظت ثابت ، رابطه   و وزن مولکولی در محدوده کوچکی به صورت خطی بوده ، در اين محدوده تخمين وزن مولکولی دقيق تر است . بنابراين بهتر است در ژل با درصد ثابت از استانداردهای با وزن مولکولی پايين ( LMW ) ، متوسط (MMW ) يا بالا ( HMW ) استفاده شود .

استفاده از استانداردهای وزنی با طيف گسترده در ژل با غلظت ثابت مناسب نيست ، چرا که اغلب اجزای اين نوع استاندارد ، در رسم منحنی استاندارد و تعيين وزن مولکولی شرکت ندارند . استانداردهای وزنی با طيف گسترده برای ژل های دارای شيب غلظت اکريل آميد مطلوب هستند . برای تعيين وزن مولکولی پروتئين ها در ژل های دارای شيب غلظت ( خطی يا غيرخطی ) اکريل آميد می توان از فرمول زير استفاده کرد .

 T غلظت اکريل آميد در حل باند پروتئينی ، a  و b به ترتيب شطب خط استاندارد و محل تلافی خط استاندارد با محور y می باشند . درحالتی که شيب غلظت ژل به صورت خطی است ، رابطه لگاريتم وزن مولکولی نسبت به لگاريتم فاصله طی شده توسط پروتئين نيز خطی است . بنابراين در اين ژل ها T به راحتی با تعيين فاصله طی شده توسط پروتئين قابل محاسبه است . در مقابل تعيين T در ژل های با شيب غلظت غطرخطی با اين روش امکان پذير نيست و با مشکلات بيشتری همراه است .

Isoelectric focusing

کروماتوگرافی الکتروفورزی

          در SDS_PAGE يا ساير روش های الکتروفورز می توان پروتئين های تفکيک شده را از بين ژل خارج نمود و برای مقاصد خاصی که به مقادير کم پروتئين نيازمند است ( همچون تعيين توالی ) به کار برد . استخراج باندهای پروتئين از ژل پلی اکريل آميد با روش های الکترودياليز ، سانتريفيوژ يا بلاتينگ        امکان پذير است .

کروماتوگرافی الکتروفورزی [12] يک روش نسبتاً جديد در خالص سازی پروتئين ها است که با آن می توان تا صدها ميکرو گرم پروتئين خالص را در زمان بسيار کوتاهی تهيه نمود . اساس تفکيک پروتئين ها در اين روش برپايه SDS_PAGE است . از طرف ديگر چون در اين روش هر پروتئن پس از رسيدن به انتهای ستون ژل ، با جريانی از بافر از آن خارج و در لوله های جداگانه جمع آوری می گردد ، مشابه روش های کروماتوگرافی هم می باشد . به همين دليل اين روش را کروماتوگرافی الکتروفورزی ناميده اند  دستگاه مورد نياز برای انجام اين روش اساساً مشابه دستگاه الکتروفو

[1] - Laemmli

[2] - Low molecular weight markers

[3] -High molecular weight markers

[4] - Swank

[5] -Munkves

[6] - Schagger

[7] - Von Jagow

[8] - Tricine: N_tris[hydroxymethyl]methlglycine

[9] - Spacer gel

[10] -Molecular weight markers

[11] - Relative mobility

[12] - Electrophoresis Chromatography

********************************

معرفی روش SDS PAGE

ژل توسط یک رنگ مثل coomasie blue R250 رنگ می شود .

رنگ و تثبیت کننده را می توان در یک محلول که حلال آن متانول است به طور همزمان استفاده کرد .

 سپس با یک محلول که حاوی اسید استیک و متانول است ژل شسته می شود تا رنگ از ژل خارج شود و فقط رنگی که با پروتئین ها باند شده است باقی بماند (destain).

(این نسبت بین 1.1g الی 2.2g SDS برای هر گرم پروتئین تغییر می کند) .

 اندازه منافذ SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis :

 این ژل ها توسط پلیمره شدن محلولی از مونومر اکریل آمید که قالب آن از دو شیشه تشکیل شده است , درست می شود . میزان درشتی و ریزی منفذهای پلیمر متناسب است با غلظت پلی اکریل آمید و عامل بوجود آورنده پیوند های عرضی.

وقتی یک مخلوط از پروتئین در ژل و در میدان الکتریکی ایجاد شده قرار می گیرد , پروتئین های کوچکتر سریعتر از درشت مولکولها از میان منافذ ژل حرکت می کنند . میزان جابجایی به اندازه منافذ ژل و قدرت میدان الکتریکی بستگی دارد . پس مولکولهای کوچکتر راحت تر از منافذ عبور کرده , در حالی که درشت مولکولها به راحتی جابجا نمی شوند .

در این متد مخلوط پروتئین و SDS که یک دترجنت آنیونی است , توسط گرما با هم باند شده اند . لذا پروتئین ها دیگر ساختمان اولیه را ندارند و فاقد پیوندهای دی سولفید هستند .

ردیابی رنگ در الکتروفورز :

عناصر سازنده شیمیایی و نقش آنها :

اندازه منافذ را 2 فاکتور کنترل می کند .(T%) مقدار درصد  acrylamide و مقدار پیوندهای عرضی (C%) . کل غلظت مونومر acrylamide-bisacrylamide = T و غلظت عامل پیوند دهنده عرضی = C . اندازه منافذ با افزایش T% کاهش می یابد و با عامل پیوند دهنده عرضی 5% کوچکترین اندازه منفذ را می دهد . هرگونه افزایش و یا کاهشی در C% باعث افزایش اندازه منفذ می شود , زیرا رابطه اندازه منفذ با C% یک رابطه پارابولیک (سهمی گونه) است . و مینیمم آن در 5% می باشد . دو لایه در ژل وجود دارد :

یکی stacking و دیگری separating .

محلولها در SDSPAGE :

ماده ذکر شده را در 10ml آب مقطر حل نمایید. این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و به صورت تازه مصرف شود . پیشنهاد اینجانب این است که در 10 میکروتیوب تقسیم شده و در فریزر نگهداری شود و جهت استفاده یکی از آنها را در آورده ، در یک نوبت مصرف نمایید .

محلول را به صورت تازه استفاده نمایید .

اين روش درکمتر از 2 ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. افزودن اتانول و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی ، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد . فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل شده و پروتئين ها را رنگ می کند. در حالی که فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.


تهیه 1000ml محلول رنگ آمیزی :

100ml از محلول آمونیوم سولفات 10% , 20ml از محلول کوماسی بلو 0.1% , 30ml از محلول اورتو فسفریک اسید 3% , 200ml از محلول اتانول 20% , 650ml آب مقطر

نحوه رنگ آمیزی :

1- پس از الکتروفورز، ژل را 2 بار به مدت 3min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید.

2- ژل را در محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو کلوئيدی به مدت 2 ساعت قرار دهید .

3- باندها باید بدون رنگ زدایی دیده شوند , اما می توانید با آب مقطر نیز رنگ زدایی کنید .

نکات مهم :

1- محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد .

2- بلافاصله بعد از رنگ آمیزی با این روش از ژل مورد نظر عکس برداری شود ، زیرا پایداری رنگ آمیزی با این روش کم است (حدود یک الی دو ساعت).

روش رنگ آمیزی ژل به روش نیترات نقره (آمونیاکی) 

این روش از سایر رنگ آمیزی ها بسیار حساس تر است . باندی که در روش کوماسی بلو ممکن است دیده نشود ، در این روش به سادگی دیده می شود .

محلول های مورد نیاز برای رنگ آمیزی :

(1): محلول ثبوت یک: 100ml محلول TCA (تری کلرواستیک اسید 20 %)

(2): محلول ثبوت دو : 40ml اتانول و 10ml اسید استیک را توسط آب مقطر به حجم 100ml برسانید.

(3): محلول گلوتار آلدهید 10%: 20ml از محلول استوک 50% گلوتار آلدهید را با آب مقطر به حجم 100ml برسانید.(به علت گرانی این ماده می توان از محلول رقیق تر استفاده کرد ولی زمان بیشتری را در نظر گرفت )

(4): محلول رنگ آمیزی (محلول نقره آمونیاکی): 21ml محلول هیدروکسید سدیم 0.36% و  1.95mlمحلول آمونیاک 25% را در یک ارلن بریزید. سپس در یک لوله آزمایش ، 0.8g نیترات نقره و 4ml آب مقطر ریخته ، حل می کنیم . محلول نیترات نقره را ، قطره قطره به محتویات ارلن اضافه کنید.در صورت دیدن رسوب قهوه ای ، به آن دو قطره آمونیاک اضافه کنید و ظرف را تکان دهید تا محلول شفاف شود . حجم نهایی را به 100ml برسانید.

(5): محلول ظهور : 10mg اسید سیتریک و 0.1ml فرمالدهید (35%) را به حجم 200ml برسانید .

(6): محلول متوقف کننده : محلول متوقف کننده همان محلول ثبوت دو (2) می باشد .

مراحل رنگ آمیزی :

1- ابتدا ژل را توسط آب مقطر و درون ظرفی که روی شیکر قرار دارد به مدت 5 دقیقه بشویید.

2- اب مقطر را از ظرف خارج نمایید .

3- محلول ثبوت (1) را روی ژل ریخته ، جوری که روی آن را بپوشاند. به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.

4- محلول ثبوت (1) را خارج کرده ، محلول ثبوت (2) را به ظرف اضافه نمایید . 20 دقیقه آن را شیک نمایید.

5- ژل را 2 بار و هر بار به مدت 5 الی 10 دقیقه با آب مقطر فراوان شیک نموده ، تا خوب شسته شود .

6- 100ml محلول گلوتارآلدهید را به ظرف اضافه کرده ، به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.

7- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 4 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.

8- محلول رنگ آمیزی را به ظرف اضافه کرده ، آن را به مدت 30 دقیقه شیک نمایید.

9- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 3 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.

10- 100ml محلول ظهور را به ظرف اضافه کرده ، ظرف را تا ظهور باندها ، بسیار آرام تکان دهید.

11- پس از ظهور باندها به صورت مطلوب ، قبل از تیره شدن زمینه ژل ، محلول ظهور را به سرعت خارج کرده ، محلول متوقف کننده را اضافه نمایید.

اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها یک ساعت طول می کشد. این روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. رنگ به صورت کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی و به رنگ سفید کدر در ژل رسوب ميکند . مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند ،شفاف باقی می مانند . برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد . اين روشها را برای ژلهای 2 -D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد . برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول-روی را می توان کاهش داد . تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد .

محلول های مورد نیاز :

محلول تثبیت کننده

50%(v/v) متانول , 5%(v/v) اسید استیک گلاسیال , 45%(v/v) آب مقطر

محلول 0.2M سولفات روی (محلول شماره 2)

28.7g سولفات روی در 500ml آب مقطر

محلول 0.2M ایمیدازول , 0.1% SDS (محلول شماره 3)

6.8g ایمیدازول , 500ml , 0.5g SDS آب مقطر

نحوه رنگ آمیزی :

1- بعد از اتمام الکتروفورز , ژل را به مدت 20min در محلول تثبیت کننده غوطه ور نمایید .

2- محلول را دور ریخته و ژل را 2 بار به مدت 15min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .

3- در محلول شماره 3 به مدت 15min و در انکوباتور , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .

4- محلول شماره 3 را دور ریخته و محلول شماره 2 را به آن اضافه نمایید . 30 الی 60 ثانیه شیک نمایید .

5- وقتی رنگ رضایت بخشی ظاهر شد , می توانید محلول را دور ریخته و به جای آن آب مقطر به ژل اضافه کنید.

در این روش رنگ آمیزی , ژلها اندکی شکننده تر به نظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. همچنین می توانید این روش را همراه با روش کوماسی بلو انجام دهید . به نحوی که پس از رنگ آمیزی کوماسی بلو , مراحل 2 تا 5 را انجام دهید .

پلیمریزاسیون ژل :

یک رادیکال آزاد که به عنوان یک آغازگر , پلیمریزاسیون ژل آکریل آمید را سبب می شود , از یکی از این دو راه تولید می شود . پروکسید یا روش فوتوشیمی . عمومی ترین روش استفاده از آمونیوم پرسولفات به عنوان یک پروکسید آغازگر است . و از TEMED به عنوان یک تسریع کننده یا (کاتالیزور) استفاده می شود .

برای پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی از ریبوفلاوین riboflavin  و اشعه UV به عنوان آغازگر استفاده می شود و از TEMED به عنوان یک کاتالیزور استفاده می شود . به محلول ژل اشعه ماوراء بنفش تابانده می شود . یک لامپ فلورسنت واکنش فوتوشیمی را آغاز خواهد کرد . پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی در مواقعی که باید قدرت یونی در ژل پایین باشد , مورد استفاده قرار می گیرد . زیرا در این روش فقط یک مقدار بسیار جزئی از ریبوفلاوین لازم است . همچنین در مواقعی که پروتئین در مقابل آمونیوم پرسولفات خیلی حساس است یا به وسیله پروکسید وارد پلیمریزاسیون می شود , از این روش استفاده می گردد .

پلیمریزاسیون آکریل آمید یک واکنش گرمازاست . پلیمریزاسیون سریع گرمای زیادی تولید می کند . این امر انتقال برق را در ساختمان ژل ناهمگون می نماید و گاهی باعث شکسته شدن شیشه آن می شود . این مشکل به طور ویژه در ژلهایی با غلظت بالا (>T 20% ) دیده می شود . برای جلوگیری از گرمای زیاد باید غلظت آغازگر – کاتالیزور را طوری تنظیم کرد , که پلیمریزاسیون در مدت 20-60min کامل شود .